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Identification and characterization a novel three component salicylate oxygenase from Sphingomonas yanoikuyae B1 : Sphingomonas yanoikuyae B1에서 방향족 탄소 화합물 분해에 관여하는 salicylate oxygenase에 관한 연구 원문보기

  • 저자

    조옥영

  • 학위수여기관

    Graduate school, Yonsei university

  • 학위구분

    국내박사

  • 학과

    Biology

  • 지도교수

  • 발행년도

    2003

  • 총페이지

    vii,47p.

  • 키워드

    방향족 탄소 화합물 분해 salicylate oxygenase Sphingomonas yanoikuyae B1;

  • 언어

    eng

  • 원문 URL

    http://www.riss.kr/link?id=T8950212&outLink=K  

  • 초록

    Sphingomonas yanoikuae B1은 단환 방향족탄화수소 뿐 아니라 다환 방향족탄화수소를 포함하는 광범위한 기질범위를 가진다.이는 탄화수소를 분해할 수 있는 다양한 oxygenase를 가지고 있기 때문이며 40 kb의 S. yanoikuyae B1 유전자 염기서열 분석결과를 보면 6개의 서로 다른 oxygenase와 oxygenase가 반응할 수 있도록 oxygenase에 전자 전달을 해 주는 하나의 ferredoxin (BphA3)과 reductase (BphA4)가 존재함을 알 수 있었다.한가지 흥미로운 사실은 S. yanoikuyae B1은 naphthalene를 성장할 수 있는 능력이 있음에도 불구하고 naphthalene 중간 대사 물질인 salicylate를 분해할 수 있는 'nahG' 유전자를 가지고 있지 않다는 사실이다.그러나 최근 연구 결과에서 oxygenase 중 하나인 bphA1c가 손상된 돌연변이체인 EK504이 naphthalene에서 자라지 못함이 관찰되었고 이는 bphA1c가naphthalene 분해에 관련되어 있는 유전자임을 알 수 있었다. 다른 naphthalene 대사 물질에 자라는지는 확인되지 않은 상태이므로 돌연변이체 EK504를 naphthalene 중간대사 물질인 salicylate에서 자라는지 확인해 본 결과 EK504는 salicylate 및 여러 종류의 methylsalicylate에서도 자라지 못함을 확인하였고 또한 EK504에 bphA1c 유전자만을 가지고 있는 재조합 플라스미드로 보상해 준 결과 naphthalene과 salicylate에서 자라는 능력을 회복함을 볼 수 있었다.이는 bphA1c가 주된 salicylate 분해 관련 유전자임을 확인할 수 되었다. 또한 보다 구체적인 BphA1cA2c의 기능 연구를 위해서 bphA1cA2c를 ferredoxin을 암호화하고 있는 bphA3과 함께 클로닝하여 대장균에서 발현시켜 salicylate 및 3-methyl, 4-methyl, 5-methylsalicylate에서의 분해여부를 HPLC및 GC-MS로 확인해 본 결과 각각 catechol, 3-methyl, 4-methyl, 5-methylcatechol로 분해됨을 확인 할 수 있었다.따라서 bphA1cA2c는 salicylate를 catechol로 분해하는 salicylate oxygenase임을 규명할 수 있었다.


    Sphingomonas yanoikuyae B1 is able to metabolize a wide variety of monocyclic and polycyclic aromatic hydrocarbon.This versatile catabolic ability is apparently due to the multiple initial dioxygenases as well as the its relaxed specificity of the initial degradative enzyme.Sequence analysis the 40 kb genomic DNA region containing aromatic-degradative genes showed that S. yanoikuyae B1 possesses least six different sets of an iron sulfur protein component (oxygenase), which are apparently associated with a single ferredoxin (BphA3) and a reductase (BphA4) components. One interesting aspect of S. yanoikuyae B1 is that a gene (nahG) encoding salicylate hydroxylase was missing although S. yanoikuyae B1 can grow on naphthalene. Previous studies raised a possibility that one of multiple oxygenases encoded by bphA1c isinvolved in naphthalene degradation since bphA1c knockout mutant EK504 is unable to grow on naphthalene.Thus, further growth tests were performed and showed that EK504 is not able to grow on (methyl) salicylate.It was also confirmed that introduction of a plasmid containing only bphA1c into EK504 results in the restoration of the ability to grow on naphthalene and salicylate. This means that bphA1cA2c is responsible for metabolizing salicylate in the degradation of naphthalene.To investigate the function of the bphA1cA2c gene in more detail, the genes for bphA1cA2c and bphA3 were amplified by PCR, and cloned together into an expression vector.The Escherichia coli strain harboring the recombinant plasmid converted salicylate, 3-methyl, 4-methyl, and 5-methylsalicylate into catechol, 3-methyl, 4-methyl, and 4-methylcatechol, respectively, as confirmed by UV-visible spectral, HPLC, and GC/mass-spectrometric analyses.


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