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Studies on the identification of symbiotic fungi using rDNA sequences : rDNA序列을 利用한 共生菌의 識別에 관한 硏究 원문보기

  • 저자

    김동훈

  • 학위수여기관

    한국교원대학교

  • 학위구분

    국내박사

  • 학과

    생물교육전공

  • 지도교수

  • 발행년도

    2004

  • 총페이지

    ix, 109p.

  • 키워드

    symbiotic fungi rDNA 공생균 생물교육;

  • 언어

    eng

  • 원문 URL

    http://www.riss.kr/link?id=T9303251&outLink=K  

  • 초록

    외생균근성 버섯들은 기주식물과 공생관계를 형성하기 때문에 인공재배에 많은 어려움이 있으며, 특히 식물체내에서의 균식별은 더욱 어렵다. 또한, 천마 종자의 발아를 돕는 난균근균의 식별도 어렵다. 따라서, 본 연구에서는 설계된 프라이머를 사용하여 식별하는 분자생물학적 기법과 해부학적인 방법을 사용하여 기주식물에서의 외생균근균 및 천마 종자발아시에 관여하는 균을 식별하려고 한다. 이러한 분자생물학적인 방법은 한 예로써 천마의 종자발아에 관여하는 공생균을 식별하는 데에도 더불어 사용되었다. 실험결과는 아래와 같다: 첫째, 외생균근균들을 식별하기 위해서 외생균근성 버섯들과 균근을 채취하여 이들 균들과 기주식물들과의 관계 및 균근형태 및 균근의 내부구조를 조사하였다. 외생균근들이 식물체 내에서 어떠한 형태로 존재하는가를 알아보기 위해서 소백산 주변의 소나무 혹은 참나무림에서 식용 버섯의 자실체 아래의 토양으로부터 균근균을 채집 한 후, 이들을 광학현미경과 전자현미경상에서 확인하였다. 송이버섯, 까치버섯, 무늬노루털버섯등은 소나무림과 관련되어 있었으며, 이들의 외생균근은 주로 옅은 갈색으로 이분지 혹은 피라미드 형태를 하고 있었다. 해부학적인 면은 mantle과hartig net, 그리고 피층 구조가 뚜렷하게 나타났다. 또한, 같은 소나무 뿌리 내에서도 외생균근균의 종류 따라 피층구조가 현저히 달랐으며, 피층세포에도 많은 균사가 침투하였음을 볼 수 있었다. 반면, 능이, 흰굴뚝버섯, 뿔나팔버섯들은 참나무림과 관련되어 있었다. 이들은 검은색의 단봉형의 외생균근을 형성하고 있었으며, mantle과hartig net의 구조가 뚜렷하지 않음을 볼 수 있었다. 특히, 무늬노루털버섯은 참나무 주변의 꼬리진달래의 뿌리와 관련되어 있었다. 그리고, 까치버섯은 소나무와 참나무림의 혼합림에서 채집되었다. 이들 자실체들의 유연관계를 PCR-RAPD를 사용하여 비교한 결과 까치버섯이 꾀꼬리과버섯에 근연종임을 확인할 수 있었다. 둘째, 본 연구에서는 분자생물학적 기법을 사용하여 식물체내에서 외생균근균을 식별하기 위하여 ribosomal DNA (rDNA)영역 ITS 영역을 이용하였다. 검은 rhizomorph로 덮혀 있는 다양한 형태의 균근들이 채집되었으며, 이들을 식별하기 위하여 ITS1F라는 일반 Primer와 담자균을 선별하기 위해 DHJ2라는 Primer를 적용하였다. DHJ2 Primer의 염기서열은 NCBI의 담자균류, 자낭균류, 접합균류, 소나무와 참나무등의 서열을 비교하여 설계하였다. 이 Primer 서열을 Blast 하여본 결과 담자균에 특이적이었으며, 식물체내에서 담자균만을 식별할 수 있었다. 이들 Primer를 통하여 Lactarius, Cortinarius, Russula, Hebeloma, Tomentella 등이 DNA 서열분석에 바탕을 두고 확인한 것이다. 셋째, 천마의 발아와 관련된 균을 식별하기 위하여 rDNA의 25S 부분을 사용하여 서열분석으로 균근균을 식별하였다. 야외에서 채집한 종자들을 3개월 이상 된 참나무 잎 조각들을 이용해 무균상태 하에서 발아시켰다. 발아에 관련된 두 개의 균종들을 새롭게 디자인한 primer, MYC1과 MYC2로 분자생물학적인 기법을 통하여 확인하였다. 일반적인 Primer(ITS1F;ITS4)와 디자인한 Primer(MYC1;MYC2)를 비교하였으며, 설계한 Primer로 합성된 DNA조각들을 서열분석으로 Mycena종들임을 확인하였다. 본 연구를 통하여 공생균인 외생균근균 및 난균근균의 rDNA의 ITS 및 25S의 염기서열에 대한 정보를 확인하고 data bank를 만들 수 있으며, 이것이 종의 식별을 위한 적절한 방법임을 알았다.


    Since mycorrhizal basidiocarps form a symbiotic relationship with host plants, it has been difficult to cultivate them under artificial conditions, and identify various fungi in host plants. It has been also difficult to identify mycorrhizae help seeds of Gastrodia elata to germinate. Therefore, this study is intended to identifying ectomycorrhiza (EM) and orchid mycorrhiza (OM) in the host plants using both molecular method with designed primers and anatomical method. A molecular method is also used in identifying symbiotic fungi seeds of G. elata as an examplae. Results are as follows: First, EM roots were collected from soils under basidiocarps of edible mushrooms of Pinus densiflora or Quercus acutissima communities at Mt. SoBaek in central Korea. EM was examined under both light microscope and scanning electron microscope. EM of Tricholoma matsutake, Poliozellus multiplex and Sarcodon imbricatum were associated with P. densiflora, and their EM looked light brown and showed a dichotomous or pyramid type. The structures of the mantle and hartig net in the cortex layers were clearly observed in the roots of Pinus. Even in the roots of one Pinus, different structures of cortex layer were shown depending upon fungal species of basidiocarps. On the other hand, Sarcodon aspratus, Boletopsis leucomelas, Craterellus cornupodides were associated with Q. acutissima. They formed black unramified EM, and their structure of mantle and hartig net was not clearly observed. In particular, the basidiocarps of S. imbricatum were associated with the roots of Rhododendron micranthum, an understory plant of P. densiflora in Korea. The basidiocarps of P. multiplex were collected in the mixed forest of P. densiflora and Q. acutissima. Also, a dendrogram could confirm that P. multiplex is closely related species with C. cornucopioides based on PCR-RAPD of their basidiocarps. Second, ribosomal DNA (rDNA) resgion was used to identify mycorrhiza fungi in plants using a molecular method in this study. This was carried out to identify the EM fungal species of the EM using PCR with designed specific primers for ITS regions of rDNA of EM fungi. Four specific primers for the EM fungi were used. These specific primers (ITS 1F/DHJ 2) of rDNA were applide to the various types of EM covered with dark rhizomorph. DHJ2 primer was designed using sequences of basidiomycetes, ascomycetes, zygomycetes, Pinus and Quercus of National Center for Biotechnology Information's (NCBI). As a result, this primer sequences are specific to basidiomycetes, and could confirm fungi in host plants. Species of Lactarius, Cortinarius, Russula, Hebeloma and Tomentella were identified based on their DNA sequence analyses. Finally, 25S rDNA was used to identify OM connected with germinating seeds of Gastrodia. Germination of G. elata is important in production of Korean herbal medicines and breeding of orchid plants. The seeds of G. elata collected from fields were examined to germinate under aseptic condition with the pieces of oak leaf for more than 3 months. Two fungal species related to germination were identified by using a molecular biological technique with a new designed primer, MYC1 and MYC2. DNA fragments synthesized with these specific primers were determined to be a species of Mycena. Therefore, OM fungus identified seemed to be a species of Mycena. In summary, sequence information of ITS and 25S of rDNA region of EM and OM which are symbiotic fungi were collected to set up a database and a molecular approach using these sequences are very useful tool to identify symbiotic fungal species.


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