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학위논문 상세정보

Serratia piyuthica A21-4 균주를 이용한 고추역병의 생물적방제 및 항균물질의 특성 원문보기
Biological control of phvtophthora blight of pepper by serratia piyuthica A21-4 and characterization of the bacterial antibiotic substance

  • 저자

    신순선

  • 학위수여기관

    경상대학교

  • 학위구분

    국내박사

  • 학과

    농업생물학과

  • 지도교수

  • 발행년도

    2004

  • 총페이지

    iv, 117장

  • 키워드

    고추역병 A21-4균 ATCC;

  • 언어

    eng

  • 원문 URL

    http://www.riss.kr/link?id=T10060126&outLink=K  

  • 초록

    본 연구는 고추재배에서 가장 큰 피해를 주는 고추역병을 생물학적으로 방제하기 위하여 고추역병균(Phytophthora capsici)에 강력한 길항능력이 있고 고추 근권에 잘 정착하는 미생물 A21-4균주를 선발하여 그 특성을 조사하고 실내실험과 농가포장실험을 통하여 A21-4균주를 이용한 고추역병의 생물적 방제 가능성을 검정하였다. A21-4균주의 역병균 억제능력을 향상시키기 위하여 배양조건과 배지 조성을 규명하였으며 고추유묘의 처리방법을 개선하였다. A21-4균주의 고추역병방제에 대한 기작을 해명하기 위하여 길항능력을 상실한 돌연변이체를 선발하여 그 유전자를 cloning하고 A21-4균주가 분비하는 항균물질을 순수 분리하여 그 구조를 동정하여 다음과 같은 결과들을 얻었다. A21-4균주의 생리학적인 특성과 형태학적인 특성들을 ATCC (American Type Culture Collection)에 보관된 Serratia plymuthica 6109D01 균주와 비교하여 조사하였고 더욱 정확한 동정을 위하여 16S rDNA sequences를 NCBI BLAST 분석시스템을 이용하여 분석하여 최종적으로 A21-4균주를 Serratia plymuthica로 동정하였다. A21-4균주의 고추역병 방제효과를 알아보기 위하여 고추묘를 A21-4 균 현탁액에 침지처리하여 Pot에 옮겨 심고 P. capsici의 zoospore를 접종하였을 경우 무처리에서는 7일째부터 발병하기 시작하여 14일째에는 83.7%의 발병율을 보인 반면에 A21-4처리에서는 전혀 발병하지 않고 건강하였다. 2001년, A21-4균주 현탁액에 침지처리한 고추묘를 고추역병균이 접종된 경상대학교 실험포장 비닐하우스에 이식하였을 경우 무처리에서는 74.5%의 발병율을 보였고 A21-4처리에서는 12.6%의 발병율을 보여 75%의 방제효과를 나타냈다. 2002년, 고추묘를 A21-4균주 현탁액에 침지처리하여 진주시 대곡면 농가비닐하우스에 이식하고 7일뒤에 A21-4균주 현탁액을 고추 근권토양에 관주처리하였다. 이식 1개월 뒤, 역병방제 화학농약 가디안을 처리한 처리구에서는 5%의 발병율을 보인 반면에 A21-4처리구에서는 전혀 발병을 하지 않았고 이식 5개월 뒤에는 화학농약 처리구에서는 27.3% 발병한데 반하여 A21-4처리구에서는 4.7%밖에 발병하지 않아 83%의 방제효과를 나타냈다. 2003년 되풀이된 포장검정실험에서는 여러 가지 환경요인으로 인하여 전형적인 고추역병 증상은 나타나지 않았지만 토양 병원균으로 인한 억제작용으로 생육에서 현저한 차이를 나타냈는데 A21-4처리구에서는 초장, 경직경, 꽃수 그리고 엽록소함량이 무처리구에 비하여 높았고 최종적으로 고추수확량이 무처리에 비하여 141.8% 증가하였다. S. plymuthica A21-4균주의 고추역병균에 대한 항균활성을 증가시키기 위하여 세균배양기의 조성을 조절하여 A21-4균주의 항균물질 생산을 현저하게 증가시킬 수 있는 최소영양배지 (Sodium citrate 0.05%, glycerol 1.0%, (NH_(4))_(2)SO_(4) 0.1%, K_(2)HPO_(4) 0.7%, KH_(2)PO_(4) 0.2%, MgSO_(4) 0.01%)를 밝혀냈다. A21-4균주를 선발된 Modified buffer (glycerol 0.1%, (NH_(4))_(2)SO_(4) 0.1%, K_(2)HPO_(4) 0.7%, KH_(2)PO_(4) 0.2%, MgSO_(4) 0.01%)와 종전에 사용하던 0.1M MgSO_(4)에 현탁하였을 경우 A21-4 농도별 고추역병에 대한 억제효과를 비교하여 보았다. A21-4균주를 0.1M MgSO_(4)에 현탁하여 고추에 처리하였을 경우 10^(9)cfu/㎖농도에서만 20%이하의 발병율을 나타내어 병억제효과가 현저하게 나타났고 10^(8)cfu/㎖과 10^(7)cfu/㎖농도로 처리하였을 경우 60%이상의 발병율을 나타내어 병억제 효과가 현저하게 낮았으나 A21-4균주를 Modified buffer에 현탁하여 고추에 처리하였을 경우 10^(8)cfu/㎖와 10^(7)cfu/㎖농도로 처리하였을 경우에도 20%이하의 발병율을 나타냈고 10^(9)cfu/㎖농도로 처리하였을 경우에는 100%의 병억제 효과를 나타냈다. A21-4균주를 Modified buffer에 현탁하여 처리할 경우 A21-4균주의 농도를 1/100으로 감소하였을 때도 동일한 효과를 나타냈다. 또한 A21-4균주를 Modified buffer에 현탁하여 고추에 처리하였을 경우 0.1M MgSO_(4)에 현탁하여 처리하였을 경우보다 고추근권 토양과 뿌리에서의 A21-4의 정착 밀도도 현저하게 증가되었다. S. plymuthica A21-4균주의 고추역병 억제능력에 대한 기작을 규명하기 위하여 Tn mutagenesis 방법으로 Omegon-Km을 삽입한 돌연변이체 3000여개를 얻었고 그중 길항능력을 상실한 돌연변이 SSM1을 선발하였다. 길항능력을 상실한 돌연변이체 SSM1은 고추역병에 대한 억제능력이 wild type 균주인 A21-4에 비하여 현저하게 감소되었지만 다른 생물학적인 특성들은 동일하였다. 길항능력을 상실한 SSM1의 유전자에 Omegon-Km이 삽입된 부분의 유전자를 알아보기 위하여 돌연변이가 일어난 부위의 유전자을 cloning하였다. 그 결과 4-diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol synthase [Yersinia pestis]을 합성하는 유전자와 유사한 DNA sequence를 나타냈다. 이런 결과로 볼 때 A21-4균주의 병 억제능력은 항균성 물질을 생산하는 유전자가 주도적으로 관여하는 것으로 추정된다. A21-4균주 wild type과 길항력을 상실한 돌연변이 SSM1의 배양산출물을 유기용매로 추출하여 그 항균활성을 비교하였을 경우 SSM1 추출물은 P. capsici와 P. ultimum에 길항력을 나타내지 않았고 TLC분석에서 볼 때 가장 항균활성이 높은 위치의 spot이 SSM1에서는 나타나지 않았다. 길항력을 상실한 돌연변이 SSM1은 A21-4균주의 가장 핵심적인 항균물질을 생산하는 유전자가 파괴되었음을 알 수 있었다. S. plymuthica A21-4가 생산하는 항균물질들을 column chromatography 을 이용하여 순수 분리하였으며 그중 가장 항균활성이 큰 물질의 구조를 IR, EI-MS, FAB-MS, NMR 등 분광학적인 분석을 통하여 분석하여 분자식이 C_(23)H_(31)O_(8)Cl이며 분자량이 470.1707인 chlorinated macrolide의 화학구조를 동정하였고 이를 chlorinated macrolide A21-4로 명명하였다. 이 물질은 스웨덴의 Thaning(2001) 등이 밝혀낸 구조와 동일하였다. 분리한 항균물질 chlorinated macrolide A21-4를 P. capsici의 유주자낭과 유주자형성 및 피낭포자의 발아에 대한 억제 효과를 조사하였고 또 P. capsici, P. ultimum, S. sclerotiorum 그리고 B. cinerea에 대한 항균활성을 probit analysis를 이용하여 ED_(50)값을 측정하였다. 그 결과 chlorinated macrolide A21-4의 0.0625㎍/㎖농도에서도 P. capsici의 유주자낭과 유주자 형성 그리고 피낭포자의 발아를 현저하게 억제하였고 P. capsici, P. ultimum, S. sclerotiorum 그리고 B. cinerea에 대한 ED_(50) 값이 각각 0.25㎍/㎖, 0.25㎍/㎖, 0.30㎍/㎖ 및 0.75㎍/㎖로 높은 활성을 나타냈다. 항균물질 chlorinated macrolide A21-4의 P. capsici와 P. ultimum 균사생장에 대한 억제 능력을 기존 시판중인 고추역병 방제 화학농약들과 비교하였을 때 높은 활성을 나타냈다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때 Serratia plymuthica A21-4는 고추역병균 Phytophthora capsici에 대하여 강력한 길항능력을 나타내는 물질을 생산할 뿐 아니라 고추근권에 잘 정착함으로 고추역병을 방제하는 이상적인 생물적방제제임을 확인할 수 있었다. 또한 A21-4는 역병균과 (Peronosporaceace)에 속하는 식물병원균 뿐만 아니라 균핵병균 (Sclerotinia)과 잿빛곰팡이 병균 (Botrytis)에도 강력한 길항력을 나타내는 것이 밝혀짐으로서 이를 토대로 다양한 미생물 농약의 개발이 기대된다.


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