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Functional Analysis of Protein Tyrosine Phosphatase 1B(PTP-1B) 원문보기

  • 저자

    하영술

  • 학위수여기관

    Graduate School, Gyeongsang National University

  • 학위구분

    국내박사

  • 학과

    Department of Medicine

  • 지도교수

  • 발행년도

    2004

  • 총페이지

    xiv, 91p.

  • 키워드

    PTP-1B Tyrosine Phosphatase 1B;

  • 언어

    eng

  • 원문 URL

    http://www.riss.kr/link?id=T10060292&outLink=K  

  • 초록

    단백질의 티로신 잔기의 가역적인 인산화는 세포의 성장, 분화, 그리고 대사 등을 조절하는 외부의 다양한 자극에 의하여 촉진되는 세포내 신호전달계의 중요한 요소이다. 단백질의 티로신 잔기의 인산화는 protein tyrosine kinases(PTKs)와 protein tyrosine phosphatases(PTPs)의 상반되는 작용을 통하여 조절되며, 이러한 상태에서 세포의 정상적인 기능은 유지된다. 하지만 PTK와 PTP 사이의 기능적인 균형이 깨어지면 비정상적인 티로신 인산화가 일어나며 결국 암, 당뇨병, 염증과 같은 질병을 유발한다. PTKs, PTPs, 그리고 이들의 기질들은 복잡한 신호전달계(signal transducing networks)를 구성하며, cellular growth, differentiation, metabolism, cell cycle, cell-cell communication, cell migration, gene transcription, ion-channel activity, immune response, survival등을 조절하는데 중요한 역할을 한다. 비록 PTP들은 세포내 신호전달계의 중요한 구성요소이지만 사람의 건강과 질병의 범주에서 그들의 중요성은 아직 완전히 이해되지 않은 실정이다. 본 연구에서는 PTP family 의 prototypic member이며 당뇨병과 비만에서 중요한 역할을 수행하는 단백질인 protein tyrosine phosphatase 1B(PTP1B)의 활성이 인산화(phosphorylation)와 산화(oxidation)에 의해 조절되는 메커니즘을 규명하고자 하였다. Part I: 인산화(phosphorylation)에 의한 PTP1B 활성 조절 본 연구실에서는 PTP1B가 티로신 인산화효소인 Src과 세린(트레오닌 인산화효소인 casein kinase Ⅱ(CKⅡ)에 의해서 인산화되며 v-src-transformed Rat-1 세포주에서 PTP1B와 Src의 직접적인 결합에 대하여 보고하였다. 이러한 보고에 기초를 두고 본 연구를 시행하였다. In vitro phosphorylation과 MALDI-TOF/MS를 사용하여 PTP1B의 20번째 아미노산인 티로신이 인산화되는 것을 확인하였다. 또한 아미노산 서열 분석을 통하여 PTP1B는 class Ⅱ SH3 도메인(PxxPx(R/K))이 결합할 수 있는 두개의 proline-rich region을 포함하고 있음을 알 수 있었다. 따라서 SH3 도메인을 가지는 Src과 직접적으로 결합하는 도메인을 확인하기 위하여 이들 proline-rich region이 제거된 일련의 deletion mutant들을 클로닝하였고 박테리에서 발현시킨 후 분리하였다. In vitro binding assay를 시행하여 PTP1B와 Src의 상호작용에는 두개의 proline-rich region과 PTP1B의 촉매 활성 부위가 관여하지 않음을 알 수 있었다. 다음으로 티로신-20이 인산화되었을 때 PTP1B의 효소활성에는 어떤 변화가 있는지 기질로 p-nitrophenol phosphate(pNPP)를 사용하여in vitro와 in vivo에서 조사한 결과에서 인산화에 의한 PTP1B 효소활성의 감소를 관찰하였다. PTP1B는 인슐린 신호전달계에서 중요한 역할을 수행한다. PTP1B의 효소활성의 감소는 세포의 인슐린에 대한 민감도를 증가시킨다는 보고가 있다. 따라서 Src에 의한 PTP1B의 효소활성의 감소가 인슐린 신호전달계를 활성화 시키는지 사람 인슐린 수용체를 발현하는 Hirc B 세포주에서 Src kinase의 저해제인 PP1과 PTP의 저해제인 Na_(3)VO_(4)를 사용하여 조사하였다. Na_(3)VO_(4)를 처리한 군에서는 증가된 인슐린 수용체의 인산화를 보여주었지만 PP1을 처리한 군에서는 대조군에 비하여 변화를 관찰할 수 없었다. 이상의 결과에서 PTP1B는 Src에 의해서 티로신-20이 인산화되며 이러한 인산화에 의하여 탈인산화효소의 활성을 감소시키는 것을 보여주었다. Part Ⅱ: 산화(oxidation)에 의한 PTP1B 활성 조절 활성산소종(reactive oxygen species)은 티로신 탈인산화효소들을 일시적으로 산화시켜 비활성화시킴으로서 티로신 인산화-의존성 신호전달계의 조절에 대한 메커니즘으로 중요한 역할을 수행한다. 티로신 탈인산화효소들은 공통적으로 그들의 활성자리에 효소활성에 필수적인 시스테인을 가지고 있다. 이들 시스테인은 대부분의 단백질에 존재하는 다른 시스테인 잔기에 비해 pK_(a) 값은 매우 낮기 때문에 시스테인 티올산 음이온(Cysteine thiolate anion) 형태로 존재한다. 따라서, 티로신 탈인산화효소의 활성자리에 존재하는 시스테인은 과산화수소와 같은 활성산소종에 의하여 산화될 수 있으며 효소활성은 저해된다. 시스테인 티올산 음이온은 불안정한 형태인 sulphenic acid(Cys-SOH)로 산화되거나 안정한 형태인 sulphinic acid(Cys-SO_(2)H) 또는 sulphonic acid(Cys-SO_(3)H)로 과산화(hyperoxidation)된다. 세포내에서 PTP1B의 다양한 산화 형태가 존재하는지 조사하기 위하여 과산화수소로 자극된 HeLa 세포주를 2D PAGE와 immunoblotting을 이용하여 분석하였다. 과산화수소를 처리한 군에서 적어도 세개의 다른 형태로 산화된 PTP1B의 spot들을 관찰할 수 있었고 이러한 spot들은 과산화수소의 처리시간에 따라 나타났다가 사라짐을 관찰하였다. PTP1B의 Cys-sulphenic acid 형태는 세포내에서 글루타티온(glutathione)에 의하여 환원된다고 보고되었다. 하지만 Cys-sulphinic acid 또는 Cys-sulphonic acid는 비가역적인 단백질 변형으로 간주되고 있다. Sulphiredoxin은 비가역적인 산화상태인 Cys-sulphinic acid 또는 Cys-sulphonic acid의 환원을 촉매하는 효소이다. 본 연구에서는 과산화상태로 산화된 PTP1B가 sulphiredoxin에 의하여 활성상태인 시스테인 티올산 음이온 형태로 환원될 수 있을 것이라는 가설을 세우고 이를 확인하였다. 먼저 사람 sulphiredoxin을 클로닝하여 박테리아에서 분리하였다. 과산화수소를 처리하여 비활성 상태로 과산화된 PTP1B의 효소활성이 분리한 sulphiredoxin을 처리하여 회복됨을 확인하였다. 사람 sulphiredoxin 유전자의 발현이 과산화수소에 의해 촉진되는지를 조사하기 위하여 RT-PCR을 수행한 결과에서 이 유전자는 항상 발현되고 있으며 inducible 하지 않다는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과들은 활성산소종에 의한 PTP1B 활성 조절의 가역적인 성질을 연구함으로서 신호전달계에서 중요한 PTP1B의 기능조절에 대한 메커니즘을 이해하는데 도움을 줄 것이라 생각된다.


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