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Study of black rockfish(sebastes schlegeli higendorf) streptococcosis, especially virulence and serodiagnosis of lactococcus garvieae isolates : 우럭(Sebastes schlegeli higendorf)의 연쇄구균증 특히, Lactococcus garvieae 국내분리주간의 균력 비교와 혈청학적 진단법에 관한 연구 원문보기

  • 저자

    강성현

  • 학위수여기관

    Graduate School, Gyeongsang National University

  • 학위구분

    국내석사

  • 학과

    Department of veterinary medicine

  • 지도교수

  • 발행년도

    2004

  • 총페이지

    ix, 41p.

  • 키워드

    Black rockfish Sebastes schlegeli higendorf 연쇄구균증 우럭;

  • 언어

    eng

  • 원문 URL

    http://www.riss.kr/link?id=T10062137&outLink=K  

  • 초록

    2001년 넙치와 방어로부터 분리, 동정된 L. garvieae 국내분리주 가운데, SJ7, TY6, YS18, 그리고, NB13에 대하여 혈청학적 분류와 우럭에 대한 병원성 확인 및 분리주간의 균력을 비교하였다. 또한, 혈청학적 진단법 개발목적으로 protein A HRP를 우럭혈청에 대하여 혈청학적 진단법에 도입하여 그 유용성을 확인하였고, 특히, 이를 이용하여 L. garvieae lysates에 대해 우럭이 인식하는 항원성 단백질을 확인하고자 하였고, 국내 한 양식장에서 L. garvieae 에 대한 혈청학적 조사 또한 실시하였다. 혈청학적 분류를 위해 L. garvieae 일본 표준 균주에 대한 토끼양성 혈청인 rabbit anti-KG(-)9408 와 rabbit anti-KG(+) 혈청을 이용하여 응집반응시험을 실시하였고, 우럭에 있어서 이들 분리주에 대한 병원성을 확인하기 위해 감염실험을 실시하였으며 25일간 임상증상과 그 치사율을 관찰하였다. Protein A HRP의 효용성 확인을 위해, 우럭 전혈청으로부터 protein A affinity column으로 정제한 우럭 Immunoglobulin과 우럭 전혈청에 대하여 immunonoblotting과 ELISA 상에서 우럭 Immunoglobulin에 대한 mouse polyclonal antibodies를 이용한 기존의 혈청학적 진단법과 비교하였고, 그 중 두가지 진단법을 이용하여 L. garvieae lysates를 2-DE 전개 후 감염실험에서 생존한 우럭의 혈청을 이용한 Immunoblotting 실시 후, MALDI-TOF MS를 이용하여 L. garvieae lysates에 대해 우럭이 인식하는 항원성 단백질을 각각 동정하여 비교하였으며, 국내 한 우럭양식장의 병어 중 25마리 random sampling하여 채취한 혈청으로 L. garvieae에 대한 항체 역가를 ELISA 상에서 각각 조사하여 비교하였다. 응집반응 시험결과 SJ7과 TY6는 rabbit anti-KG(-)9408 혈청에는 낮은 희석배수에서 응집하거나 응집되지 않았고 rabbit anti-KG(+)혈청에 대해서는 모두 응집이 되지 않아 SJ7과 TY6 분리주는 capsule과 fimbriae가 있는 KG(-) phenotype으로 예상되며, YS18과 NB13 분리주는 rabbit anti-KG(-)9408과rabbit anti-KG(+)혈청 모두 높은 희석배수에서 응집이 되어 micro-capsule과 fimbriae가 존재하는 MS93003 형이거나 두가지 형태가 없는 KG(+)phenotype으로 예상되었다. 또한, 우럭에 대한 감염실험 결과, 25일 동안, SJ7과 TY6에서 각각 100%와 60%의 높고 빠른 치사율을 보였으며, YS18과 NB13 분리주에서는 모두 20%의 치사율을 확인하였다. 혈청학적 분류와 감염실험결과 통해 모두 SJ7과 TY6 분리주가 균력이 높은 것으로 보고되고 있는 KG(-)phenotype으로 분류될 수 있을 것이며, YS18과 NB13 분리주는 MS93003과 같은 penotype이거나 KG(+) phenotype으로 분류할 수 있을 것이다. 또한, 우럭에 있어서 본 실험에 사용된 국내분리주 모두에서 병원성을 확인할 수 있었고, 특히, SJ7과 TY6이 균력이 높은 것으로 확인되었다. 우럭의혈청학적 진단법에 대한 protein A HRP의 유용성 확인 위해 기존의 혈청학적 진단법에 주로 사용하고 있는 우럭 Immunoglobulin 에 대한 mouse polyclonal antibody를 Immunonoblotting 상에서 비교한 결과, 두 방법 모두 70 kDa 에서의 단일 밴드를 확인할 수 있었고, 우럭 전 혈청에 대해 우럭 Immunoglobulin에 대한 mouse polyclonal antibody 적용시 25 kDa 또한 확인 할 수 있었다. L. garvieae lysates를 2-DE 전개 후 감염실험에서 생존한 우럭의 혈청을 이용한 Immunoblotting 실시 후, MALDI-TOF MS로 PMF 실시하여 L. garvieae lysates 에 대해 우럭이 인식하는 항원성 단백질을 각각 동정한 결과 8개의 항원성 단백질 즉, 30S ribosomal protein S2, elongation factor G, elongation factor Tu, Enolase, glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase, fructose-1,6-bisphosphatase, Arginine deiminase and dTDP glucose 4,6-dehydrogenase 등을 두 방법 모두에서 확인할 수 있고, protein A HRP를 사용한 것이 mouse polyclonal antibody를 사용한 것 보다 높은 intensity 와 적은 background를 확인 할 수 있었다. L. garvieae 에 대한 우럭양식장의 항체가를 조사한 결과 25마리 중 20마리가 양성, 5마리가 음성으로 나타났으며, 서로 다른 conjugates를 사용한 ELISA 결과를 회귀 분산을 통해 조사한 결과 P value 가 0.05보다 커 유의하지 않음, 즉, 동일한 방법임을 확인하였다. 본 연구에서는 국내 생산량의 많은 부분을 차지하는 우럭에 대하여 L. garvieae에 대한 피해 가능성을 확인 할 수 있었고, 우럭의 혈청학적 진단에 우럭 Immunoglobulin에 대한 polyclonal antibodies을 대신하여 protein A HRP를 적용함으로써, 보다 신속하고 간편한 진단의 가능성을 밝혔고, L. garvieae에 대한 보다 많은 혈청학적인 조사와 백신개발의 필요성 또한 확인할 수 있었다.


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