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Regulatory mechanism on the initiation of replication and its copy number control of plasmid pJB01 iPrsolated from gram positive enterococcus faecium JC1 : 그람 양성 세균인 Enterococcus faecium JC1으로부터 분리한 plasmid pJB01의 복제 개시 및 copy number 조절 기작 연구 원문보기

  • 저자

    김삼웅

  • 학위수여기관

    Graduate School, Gyeongsang National University

  • 학위구분

    국내박사

  • 학과

    Division of Applied Life Science

  • 지도교수

  • 발행년도

    2004

  • 총페이지

    xvi, 131p.

  • 키워드

    그람양성세균 PLASMID 조절기작 응용생명과학;

  • 언어

    eng

  • 원문 URL

    http://www.riss.kr/link?id=T10062146&outLink=K  

  • 초록

    본 논문은 그람 양성 세균인 Enterococcus faecium JC1으로부터 새로이 분리한 plasmid pJB01의 복제 양식을 규명하고 이 plasmid의 복제 개시 인자인 RepB의 functional domains을 돌연변이를 통해 분석하였으며 복제 조절 인자들인 CopA, ctRNA, RepB, RepC등의 역할에 관하여 분자생물학적 및 생화학적 특성들을 연구하였다. Plasmid pJB01은 그람 양성 세균인 Enterococcus faecium JC1으로부터 분리하였다. Full sequencing한 결과 이 plasmid의 전체 DNA 길이는 2,235 bps이었으며 가상적인 double-strand origin (dso), single-strand origin (sso)과 세 개의 open reading frames (orfs)를 보유하고 있었다. 가상적인 dso에는 IR (Inverted repeat)-III 및 three tandem repeats가 포함되어 있었다. RCR (Rolling circle replication)에 의해 복제하는 다른 plasmids와 비교할 때 본 plasmid dso의 nick site 주변 DNA sequence는 pMV158 family와 상동성이 높게 나타났다. 이 plasmid의 sso는 IR-I과 II을 포함하는 영역으로 구성되어 있었으며, pWV01의 ssoW와 94%의 상동성을 보였다. 또한, 이 sso에는 RCR을 수행할 경우 lagging strand의 복제 개시 시에 RNA polymerase가 결합하는 부위인 RS_(B) (Recombination Site B)와 이 효소에 의해 합성된 RNA primer로부터 DNA 합성으로 전환점이 되는 CS6 (consensus sequence composed of 6 nts)가 잘 보존되어 있었다. 3개의 orfs는 하나의 operon을 구성하며, 이 operon의 전사 개시는 primer extension 실험을 통해 pJB01 유전자 지도에서 T695 또는 A696에서 될 것이다. 본 plasmid의 ORF A는 다른 plasmids에서 copy 수를 조절하는 것으로 알려져 있는 Cop proteins와 상동성이 있었다. 또한, ORF B는 다른 plasmids의 RCR 개시 인자와 상동성이 있었다. 이와는 다르게 ORF C의 경우 기능의 상동성 면에서 일치하는 단백질이 없어서 예측이 불가능하였다. 다른 RC plasmids과 leading strand 복제에 관련된 인자들의 비교를 통해 이 plasmid는 RCR을 행하는 5개의 family들 중 하나인 pMV158 family에 포함됨을 알 수 있었다. 가상적인 dso내의 nick site는 - leading strand의 복제 개시 때 RepB에 의해 nicking이 일어나는 장소 - nic region의 2차 구조상에서 볼 때 intermediate loop에 존재하는 G525와 A526 사이에 위치할 것으로 판단되었다. 모든 pMV158 family에 속하는 plasmid들은 2 or 3 direct repeats을 dsos내에 가지며, 이들은 Rep proteins의 DNA와의 결합을 위해 필요한 장소로 알려져 있다. 그러나, pJB01의 경우 dsos내에는 5'-CAACAAA-3'로 구성된 3개의 tandem repeats가 존재한다. 이들은 각 4 nts에 의해 분리되어 있고, nick site로부터 77 nts의 하류에 위치하였다. pMV158 family간의 direct 또는 tandem repeats의 비교 분석은 nick site로부터 위치와 bind regions을 구성하는 DNA sequence들에 따라 4개의 subgroup으로 나눌 수 있었다. 이 중 pJB01은 pLC2와 pPF107-3과 함께 동일한 subgroup II에 포함되었다. pJB01 RepB의 N-terminus는 pMV158 family의 Rep들과 비교해 보면, RI∼V 영역에서는 매우 높은 보존성을 유지하지만, C-terminus는 보존성이 낮았다. 이 보존된 영역에 다양한 돌연변이를 유도한 RepB들을 사용하여 topoisomerase I-like 활성의 유지 여부를 분석하였다. 그 결과 본 plasmid RepB N-terminus의 보존된 부위들은 nicking과 nick-closing에 매우 중요함을 확인할 수 있었다. Hybrid-N을 사용한 경우 활성이 나타나지 않는 것으로 볼 때, topoisomerase I-like 활성을 위해서는 N-terminus의 존재 자체는 물론이고 아미노산의 정확한 배열이 필요함을 시사하였다. 특히, RepB의 Y100 잔기는 이 활성에 결정적인 역할을 할 것으로 보였다. 그러나, RepB C-terminus에의 돌연변이의 도입은 이활성에 실질적인 영향을 주지 않았다. 가상적인 helix 영역인 92-108내에 포함된 Y100과 E104의 부위가 치환된 RepB에 대한 활성 실험으로부터 이 아미노산들이 중요한역할을 함을 보여 주었다. RepBΔN, RepBΔC, Hybrid-N과 Hybrid-C등을 사용하여 행한 실험 결과 N-과 C-terminus가 DNA binding에 필요함을 시사하는 결과를 얻었다. 특히, Hybrid-N과 C를 사용한 DNA binding 실험으로부터는 이 단백질의 정확한 3차 구조가 DNA 결합에 매우 중요함을 나타내 주었다. RepB는 in vivo에서 발현량이 적절할 때는 복제 개시 인자로서 양(陽)의 조절 인자이지만, 정상적인 요구량보다 과량으로 발현이 될 때는 아직 밝혀지지 않은 어떤 수단으로 음(陰)의 조절 인자로서 역할을 보이는 결과를 얻었다. CopA는 repABC operon의 가상적인 operator 영역에 결합함으로써 전사 수준에서 이 operon의 음(陰)의 조절 인자로서 autoregulation을 수행할 것으로 판단되었다. Primer extension 실험을 통해 pJB01의 ctRNA는 A947에서 전사가 개시되며, copA와 repB gene 사이에 72 nucleotides 안에서 전사가 완료되어 54 nucleotides로 구성될 것임을 예측할 수 있었다. pJB01 repB gene의 upstream region에는 plasmid pMV158내의 이와 상응하는 rep gene의 upstream region에 존재하는, 두 개의 보존된 영역 (underlined)으로 구성된, TTTTTGT...4 nucleotides....TAA....9 nucleotides....ATG, ARBS (atypical ribosome binding site)를 보유하고 있다. ctRNA는 repABC mRNA내 repB의 ARBS를 구성하는 두 개의 보존된 영역 중 단지 5'-말단 (5-TTTTTGT-3')만에 상보적인 배열과 일치하는 영역에서 전사가 개시되며, 이 상보적인 배열은 2차 구조의 terminal loop으로부터 멀리 떨어져 존재하였다. Mfold program을 이용하여 행한 ctRNA의 2차 구조 형성 가능성 예측으로부터 terminal과 internal hairpin loops을 생성하는 것이 가능한 것으로 나타났지만, RNase T1과 lead acetate에 의한 분석 결과로부터는 대부분의 ctRNA 개체들이 안정한 hairpin loops을 생성하기는 어려울 것으로 보였다. repB mRNA (796 bp)에 의한 in vitro translation은 첨가한 ctRNA의 농도와는 반비례하여 발현되었다. Terminal과 internal hairpin loops내에 돌연변이가 도입된 plasmids는 wt ctRNA을 갖고 있는 pJB01 ermC와 비교했을 때 copy 수의 증가를 보였다. Terminal hairpin loop에 돌연변이를 도입시킨 pJB01-3과 5는 copy수면에서 wt보다 3.1, 3.5 배로 각각 상승하였다. Internal hairpin loop에 돌연변이가 도입된 pJB01-6은 ARBS에 상보적인 영역이 stem 부위에서 linear 영역으로 변화됨으로써 0.2 배로 그 copy 수가 감소하였다. 두 개의 hairpin loops에 돌연변이가 도입되었지만, internal hairpin loop의 원래 형상을 유지하고 있는 pJB01-1과 4는 1.8과 2.7 배로, terminal hairpin loop에만 돌연변이가 도입된 경우보다는 낮게 copy수의 증가면에서 미치지 못하였다. 이것은 두 종류의 loops과 이들 사이에 존재하는 stems의 구조 변화로 인해 target mRNA와 결합력이 pJB01-3과 5보다 증가한 것으로 추정된다. Internal loop의 원래 구조가 파괴되고 terminal loop 구조에도 변화가 발생한 pJB01-2는 5.4 배의 copy 수 상승 효과를 보였다. 이와 같은 결과들은 이들 loops 구조의 파괴로 인해 ctRNA와 target mRNA 사이의 결합이 억제됨을 의미한다. 그러므로, 이들의 원래 구조들은 ctRNA와 target mRNA사이의 initial kissing complex와 이것의 extending complex 형성에 중요한 역할을 할 것으로 보인다. RepB가 replication initiator로서 결합하는 장소인 three tandem repeats를 포함하는 73 bps PCR product에 RepC는 결합하지 않았다. 그러나 반응액에 RepB와 RepC가 동시에 첨가될 경우, RepB만일 경우에 gel상에 보여준 retarded bands이외에 추가로 3개의 bands가 보였다. 이로부터 RepC는 RepB와 protein-protein 결합을 통해 DNA와 결합을 할 것으로 추정된다. 또한, pJB01 ermC로부터 RepC가 결손 된 plasmid들은 wt pJB01 ermC에 비하여 1.4-1.5 배로 그 copy number가 증가하였다. 이는 RepC가 pJB01의 복제에 있어서 음(陰)의 조절 인자로서 역할을 함을 시사하고 있다.


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