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학위논문 상세정보

소 형질전환 수정란 생산 및 이식 원문보기
Production and transfer of transgenic bovine embryos

  • 저자

    이성림

  • 학위수여기관

    경상대학교

  • 학위구분

    국내석사

  • 학과

    Department of Veterinary Medicine

  • 지도교수

  • 발행년도

    2004

  • 총페이지

    xx, 111장

  • 키워드

    transgenic bovine embryo embryo 소 형질전환 수정란 생산이식;

  • 언어

    eng

  • 원문 URL

    http://www.riss.kr/link?id=T10062175&outLink=K  

  • 초록

    지난 수년간 생명공학 분야에 대한 무한한 도전에 의해 많은 연구가 수행되어졌으며, 그 중 핵 이식 기법을 이용해서 소, 양, 산양 그리고 돼지 등의 형질전환 동물의 생산이 가능하게 되었다. 그러나 이러한 형질전환 동물은 생산 효율이 낮고 임신 시 조기 및 후기 배 사멸율이 높게 나타나는데, 이는 비정상적인 핵의 재구성(reprogramming), 유전자 발현과 apoptosis 등 여러 요인이 형질전환란의 발달에 영향을 주기 때문이다. 따라서 본 논문에서는 효율적인 세포내 유전자 도입 방법을 구축하고 이를 공핵으로 사용하여 핵이식 방법으로 형질전환란을 생산하고 분석하여 보다 효율적인 형질전환 소를 생산하고자 하였다. 배아 섬유세포(fetal fibroblasts, FFB), 난구 세포(cumulus cells, CUC) 그리고 성체 귀 피부세포 (adult ear skin cells, ESC)에 유전자를 도입하기 위한 방법으로 cationic liposomes reagent인 Effectene (Qiagen inc.)과 전기 융합방법의 이용하였으며, 세포주기, 염색체 이상, 유전자 발현 효율 그리고 terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) nick-end labelling (TUNEL)을 이용한 apoptosis 발현을 분석하여 유전자 도입에 효율적인 세포종류와 유전자 도입 방법을 구축하였다. 유전자가 도입된 공핵을 이용한 형질전환란(TG)과 핵이식란(NT), 체외수정란(IVF)의 발달율, 세포수, 핵형, 유전자 발현효율 그리고 apoptosis 발현율을 조사하였다. 핵이식 및 형질전환란 생산 과정은 다음과 같이 수행되어졌다. 핵이식에 이용될 공핵의 배양은 10% FBS가 첨가된 -MEM에서 pEGFP-N1(Clontech lab.)유전자를 도입하기 위하여 5-7일 간격으로 계대 배양하였다. 수핵란의 준비는 도축장 유래의 난소에서 채란된 미성숙 난자를 20-22 시간 동안 체외 성숙 시킨 뒤 제1극체와 제1감수분열 중기단계의 핵을 미세조작 기술을 이용하여 제거한다. 핵이 제거된 수핵란에 유전자가 도입된 공핵을 이식하고 전기 세포융합기 (BTX 200)을 이용하여 DC pulse (1.6 KV/cm, 30 usec) 조건으로 2번 전기자극을 주어 재조합 수정란을 만든다. 재조합 수정란은 ionomycin (5 uM)으로 4분간, cycloheximide (10 ug/ml)로5시간 동안 활성화 처리를 하고 체외 배양액인 SOF 배양액에서 39℃, 5% CO_(2), 90% N_(2) 배양기에서 7일간 배양한다. 실험군의 결과에 대한 유의차 검증은 one-way ANOVA을 이용하였다. FFB, CUC, ESC 세포의 세포주기를 분석한 결과 pEGFP-N1 유전자를 도입하거나 하지 않은 세포에서 85% 이상이 G0/G1 세포주기를 나타내서 핵이식에 적합한 세포주기를 가지는 것으로 나타났으며, 염색체와 apoptosis 발현은 차이가 나타나지 않는 것으로 나타났다. 그러나 pEGFP-N1 유전자의 도입 효율은 FFB 가 CUC와 ESC에 비하여 유의적 (P


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