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학위논문 상세정보

Role of CopA on the repABC gene expression at the transcriptional level : 병원성 세균 Enterococcus faecium JC1에 존재하는 플라스미드 pJB01의 repABC 발현에 영향을 미치는 CopA 단백질의 역할규명 원문보기

  • 저자

    탁제일

  • 학위수여기관

    Graduate School, Gyeongsang National University

  • 학위구분

    국내박사

  • 학과

    Division of Applied Life Science

  • 지도교수

  • 발행년도

    2004

  • 총페이지

    vi, 28p.

  • 키워드

    병원성세균 화학공학 Enterococcus faecium 플라스미드 repABC CopA;

  • 언어

    eng

  • 원문 URL

    http://www.riss.kr/link?id=T10062194&outLink=K  

  • 초록

    많은 플라스미드들은 자신이 host내에서 살아남기 위해서 복잡하면서도 정교한 기작으로 copy number를 조절한다. 복제를 negative하게 조절하는 방법은 크게 세 가지로 나눌 수 있는데, 첫 번째는 P1의 경우처럼 복제 개시 단백질(Rep protein)이 origin내의 지정된 결합 부위(iteron)와 반응하여 복제 개시를 방해하는 방법과, pT181처럼 antisense RNA를 만들고 그것의 상보적 RNA에 결합시킴으로써 복제를 제어하는 방법, 마지막으로 pMV158처럼 repressor protein과 antisense RNA를 모두 사용하여 복제를 조절하는 방법이다. 우리 실험실에서는 병원성 세균인 Entrerococcus faecium JC1에서 플라스미드 pJB01을 분리하고, 이 플라스미드의 1차 구조를 바탕으로 복제 특성을 유추해 본 결과, 이것이 Streptococcal bacteria계 플라스미드인 pMV158과 유사함을 알게 되었고, 이것의 복제 조절 기작은 앞에서 언급된 복제의 negative 조절 방법 중 세 번째인 repressor protein과 antisense RNA를 이용할 것으로 판단되었다. 즉, 복제 개시 관련 단백질 중 하나인 CopA가 자신의 promoter에 RNA polymerase와 경쟁적으로 결합함으로써 전사 작용을 저해하고, 여기에 보조적으로 antisense RNA가 ribosome 결합 부위와 복합체를 형성함으로써 ribosome의 translation을 방해하는 형식을 취할 것으로 보인다. 본 연구에서는 병원성 세균인 Gram-positive 세균 내에 존재하는 플라스미드의 복제 개시 조절 기작을 밝히기 위해 우선, Enterococcus faecium JC1에서 새로운 플라스미드인 pJB01을 분리하고, pBluescript 벡터에 cloning후, Erase-a-Base system Kit를 사용하여 전체 DNA의 염기 서열을 밝혔다. 1차 구조에 근거하여 추정해 본 복제 조절 관련 인자 중 CopA homologue의 역할 및 기능 부위에 대해 좀 더 자세하게 규명하기 위해서 pJB01에서 copA 상응하는 부위를 포함하는 DNA단편을 잘라 subcloning하였고, 이것으로부터 우선 GST-fusion 단백질을 얻은 후, 결합 예상 부위의 PCR product와 gel retardation assay를 통하여, CopA단백질의 cis-element의 promoter와 operator부위를 확인하였다. 특히, CopA 단백질내의 기능 부위를 알기 위하여 DNA 결합 motif인 RHH구조로 예상되는 부위내의 몇몇 아미노산을 point mutation시켜서 R16M, K26R, E50V와 같은 mutant들을 만들고 wild-type의 경우와 전사량을 비교해 보았다. In vitro transcription assay 및 RT-PCR을 사용한 실험으로부터 이들 돌연변이체의 repABC의 발현량이 wild type의 경우보다 많이 증가하는 것을 볼 수 있었다. 또, 본래 숙주 세균인 Enterococcus faecium JC1을 사용하여 copy number를 비교한 실험에서도 돌연변이 체들이 wt보다 더 나은 복제효율을 나타내었다. 특히, in vitro transcription assay의 경우, mutant중 하나인 E50V가 CopA의 wild type보다 6∼10배 가량 높은 발현 양을 보였는데, 이상과 같은 결과로부터, pJB0l CopA는 RepB의 발현을 전사 level에서 negative하게 조절한다는 사실을 알 수 있었고, 특히, CopA의 50번째 아미노산인 glutamate가 다른 부위들보다전사 조절 면에서 더욱 중요한 역할을 할 것으로 판단할 수 있었다.


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