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학위논문 상세정보

Agrobacterium tumefaciens 를 매개로 한 벼(Oryza sativa L.)의 효과적인 형질전환 원문보기
Effective Transformation of Rice(Oryza sativa L.) Mediated by Agrobacterium tumefaciens

  • 저자

    서미숙

  • 학위수여기관

    順天大學校 大學院

  • 학위구분

    국내석사

  • 학과

    자원식물개발학과

  • 지도교수

  • 발행년도

    2004

  • 총페이지

    52p.

  • 키워드

    벼 형질전환 Agrobacterium tumefaciens;

  • 언어

    kor

  • 원문 URL

    http://www.riss.kr/link?id=T10062755&outLink=K  

  • 초록

    벼의 Agrobacterium을 이용한 효율적인 형질전환계를 개발하기 위하여 기존의 식물 조직배양계와 형질 전환조건을 재검토하였다. 벼의 성숙 종자로부터 유도된 3주째 캘러스를 사용하여 기존 재분화 배지에서의 탄소원 조합, 호르몬 조합등을 조사 한 결과 sucrose 15g/L, sorbitol 30g/L, casamino acid 4g/L, L-proline 0.5g/L, NAA 0.5g/L, BA 2mg/L, gelrite 4g/L가 첨가된 MS 배지에서 가장 높은 재분화 효율을 관찰할 수 있었다. 또한 T-DNA 내 부에 intron-gus 유전자를 포함하는 pIG121Hm 유전자를 감염시킨 후 형질 전환 조건을 검토한 결과 3일간 전배양한 후 균을 접종하고 CaCl_(2) 50mg/L, betaine 120mg/L가 함유된 공동 배양 배지에서 암 조건으로 10일간 공동 배양하였을 때 높은 GUS 발현을 나타냄을 알 수 있었다. 그러나 2,4-D와 acetosyringone을 농도별로 첨가하여 GUS 발현을 조사한 결과 기존의 농도와 별다른 차이점을 발견할 수 없었다. 검토된 재분화와 형질전환 계를 이용하여 내한성에 관계되는 GPAT 유전자와 거대 유전자를 벼에 형질전환 한 결과 각각 41%와 33%의 높은 형질전환율을 나타내었다. GPAT 유전자로 형질전환된 식물체와 대조 식물체를 Southern blot 분석한 결과 GPAT 유전자가 완전하게 식물체내로 삽입되었음을 확인할 수 있었으며 SDS-PAGE 분석 결과 형질전환 식물체와 대조 식물체의 단백질 밴드에는 아무런 차이점이 발견되지 않았다. 거대 유전자로 형질전환된 식물체와 대조 식물체를 PCR 분석한 결과 거대 유전자가 식물 게놈상에 안전하게 삽입되었음을 알 수 있었다. 검토된 재분화와 형질전환조건을 이용하여 지금까지 비교적 재분화율이 낮고 Agrobacterium을 통한 형질전환이 매우 까다로운 벼의 향미 및 흑미의 인디카와 자포니카 품종의 캘러스 유도율과 재분화율을 조사하였다. 모든 품종에서 캘러스는 유도되었으며 그 범위는 18%의 Kuroine에서 90%의 Nezumimai까지 다양하게 조사되었다. 20품종에서, 18품종은 shoot 재분화를 보였으며 재분화율은 Guongzuonmi, Kuroine에서의 8.3%부터 Dongjin에서의 91%까지의 범위로 나타났으며 캘러스 당 최대 shoots의 수(8.68)도 Dongjin에서 나타났다. 반면에 2 품종은 캘러스로부터 어떠한 shoot 재분화도 관찰되지 않았다. 이러한 결과들은 벼의 식물체 재분화 능력이 유전자형에 강하게 영향을 받는다는 것을 나타낸다. 현재 우리는 검토된 형질전환 조건을 사용하여 높은 재분화율올 가진 향미와 흑미 품종의 형질전환 식물체를 생산하고 있다.


    Effective regeneration and transformation system have developed for the production a large number of transgenic plants of rice. Shoot regeneration from three-week-old mature-derived calli were tested. The optimum shoot regeneration were obtained when calli cultured on to MS medium containing sucrose 15g/L, sorbitol 30g/L, casamino acid 4g/L, L-proline 0.5g/L, NAA(α-naphthaleneacetic acid) 0.5mg/L, BA(benzyl adenine) 2mg/L, gelrite 0.4%. It is convenient to use pIG121Hm containing GUS in the T-DNA for optimization of the conditions for transformation. In our study, high GUS expression was observed when infected calli after pre-culture for 3 days were cultured in the dark on co-culture medium containing CaCl_(2) 50mg/L, betaine 120mg/L for 10 days. However, there were no significant change in the levels of GUS expression resulting from acetosyringone and 2,4-D concentration. In the study evaluated here, We have demonstrated the effect of this systems when the GPAT gene correlated chilling resistance and large fragment DNA were transferred by Agrobacterium tumefaciens in rice. A high transformation efficiency of approximately 41% and 33% were observed. Integration of GPAT genes into the genome of transgenic plants was confirmed by southern blot analysis. In SDS-PAGE analysis, a band difference between control and transgenic plants not showed. Integration of large fragment DNA into the genome of transgenic plants also was confirmed by PCR analysis. In order to production of transgenic aromatic rice and purple seed rice, we examined regeneration frequency that significant affect transformation. Of the 20 cultivars, 18 cultivars showed shoot regeneration. The shoot regeneration frequency ranged from 8.3% for cvs 'Guongzuonmi', 'Kuroine' to 91% for cv 'Dongjin'. The maximum number of shoots per callus(8.68) was obtained in cv 'Dongjin'. These results indicate that shoot regeneration ability is strongly influenced by genotype in rice. We are currently producing transgenic plants of aromatic rice and purple seed rice with high regeneration frequency by using the investigated transformation conditions.


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