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들잔디(Zoysia japonica steud)의 식물체 재분화와 Agrobacterium tumefaciens을 이용한 bialaphos 저항성 유전자의 도입 원문보기
Plant regeneration and Agrobacterium tumefaciens-mediated tramsformation with bialaphos resistant gene in Zoysiagrass (Zoysia japonica steud)

  • 저자

    원산굉일

  • 학위수여기관

    順天大學校 大學院

  • 학위구분

    국내석사

  • 학과

    자원식물개발학과

  • 지도교수

  • 발행년도

    2000

  • 총페이지

    59p.

  • 키워드

    들잔디 Zoysia japonica steud 식물체 재분화;

  • 언어

    kor

  • 원문 URL

    http://www.riss.kr/link?id=T10062779&outLink=K  

  • 초록

    본 연구는 들잔디(Zoysia japonica steud.)의 식물체 재분화와 Agrobacterium tumefaciens를 이용한 bialaphos 저항성 유전자도입을 목적으로 실시하였다. 들잔디 종자의 callus 유도는 2 mg/l 2,4-D와 0.2 mg/l BA가 포함된 MS배지에서 가장 높은 빈도로 유도되었다. 생장조절물질(2,4-D와 BA)의 조합에 따라 4 types의 callus가 유도되었다. Type 1은 callus의 초기단계로부터 분화가 관찰되는 callus, type 2는 희고 치밀하고 표면이 단단한 callus, type 3은 노랗고 치밀하고 부스러지기 쉬운 callus, type 4는 부드럽고 물기가 있는 callus의 특정을 갖고 있다. 이 중에서 식물체재분화 능력이 있는 callus는 type 1, 2, 3의 형태를 갖고 있고, type 4는 식물체재분화능력을 전혀 보이지 않았다. 특히 type 1 callus는 2,4-D와 BA의 조합에 따라서 callus 증식과정에서 4 types의 callus로 분리 증식되는 것을 관찰할 수 있었다. callus의 증식이 가장 좋은 생장조절물질의 조합은 type 1, 2, 4의 경우 0.5 mg/l 2,4-D와 0.05-0.1 mg/l BA 포함된 배지이고, type 3(식물체재분화 능력이 가장 좋은 type)은 4 mg/l 2,4-D와 0.01 mg/l BA에서 관찰되었다. 식물체 재분화에 미치는 생장조절물질, 당류, gelrite의 최적농도를 조사한 결과, 1 mg/l의 BA, 30 g/l maltose, 2-4 g/l gelrite 포함된 MS배지에서 재분화 효율이 가장 높았다. Agrobacterium tumefaciens를 이 용하여 organogenic callus에 hygromycin 저항성유전자와 bialaphos저항성유전자를 형질전환 하였다. 형질전환 식물체는 PCR 분석을 통하여 염색체내에 hygromycin 저항성유전자와 bialaphos저항성유전자가 삽입되어있는 것을 확인하였고 또한 형질전환식물체는 잎 표면에 제초제를 처리한 in vivo실험에서도 저항성을 보여주었다.


    In this study, plant regeneration and Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation with bialaphos resistant gene were achieved in Zoysiagrass (Zoysia japonica steud.). The highest callus induction frequency was obtained from scutellar tissue of mature seeds on MS callus-induction medium supplemented with 2 mg/l 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 0.2 mg/l N^(6)-benzyladenine (BA). Different types of callus were produced, depending on the growth regulators combinations. Callus was characterized to four types, which were callus with differentiated structure (type 1), white, compact and non-friable callus (type 2), yellow, compact and friable callus (type 3), and soft and watery callus (type 4). The combination of auxin and BA, compared to auxin alone, resulted in more regenerable organogenic callus(type 1, 2, and 3) which was the most induced on the culture medium containing 2 mg/l 2,4-D and 0.2 mg/l BA. Subculture of type 1 callus on medium with growth regulators combinations resulted in different mixture rates of callus type 1, 2, 3, and 4. The best growth of callus type 1, 2, and 4 was obtained on 0.5 mg/l 2,4-D and 0.05-0.1 mg/l BA, but that of type 3 callus exhibited more efficient propagation on 4 mg/l 2,4-D and 0.01 mg/l BA. type 3 callus produced little albino plants, while others produced more albino shoots. The multiple shoot induction was enhanced by maltose 30 g/l, 2-4 g/l gelrite, and 1 mg/l BA. The organogenic calli were inoculated with Agrobacterium tumefaciens strain EHA101 harboring the binary vector pGPTV-HB containing hygromycin phosphotransferase (HygR) and the phosphinothricin acetyl transferase (Bar) genes. The inoculated calli with Agrobacterium were regenarated on MS regeneration medium supplemented with 1 mg/l BA. Transgenic shoot were selected on 30 mg/l bialaphos-containing media. Rooted transgenic plant were established in soil. Stable integration of Bar gene into chromosomal DNA was confirmed by basta-painting test in leaf section and PCR analysis. Using EHA101 harboring pIG121Hm with β-glucuronidase gene, various factors were found to influence the transfer-DNA delivery efficiency. When calli were transferred to co-cultivation medium with 4 mg/l 2,4-D and 0.01 mg/l BA after infection and cultured in the light for 10 days, gus spots were increased 300 times. In the present work, we reported the first bialaphos-resistant plant by Agrobacterium-mediated transformation in Zoysia japonica steud.


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