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학위논문 상세정보

In vivo 및 in vitro assay를 이용한 hnRNP A1과 결합하는 단백질의 결정 원문보기
Determination of proteins interacting with hnRNP A1 using in vivo and in vitro assays

  • 저자

    윤지영

  • 학위수여기관

    鮮文大學校 大學院

  • 학위구분

    국내석사

  • 학과

    응용분자생물학과

  • 지도교수

  • 발행년도

    2004

  • 총페이지

    iv, 46p.

  • 키워드

    in vivo in vitro assay hnRNP A1 단백질;

  • 언어

    kor

  • 원문 URL

    http://www.riss.kr/link?id=T10067204&outLink=K  

  • 초록

    진핵세포에서 RNA polymerase II에 의해 전사된 primary transcripts는 크기가 다양하고 핵에 존재하기 때문에 heterogeneous nuclear RNA (hnRNA)라 한다. hnRNA의 일부는 mRNA의 전구물질인 pre-mRNA로서 processing 되어 mRNA로 된다. hnRNA들은 여러 단백질들과 결합하여 복합체를 이루게 되는데, hnRNA와 결합하는 단백질들을 heterogeneous nuclear ribonucleoproteins (hnRNPs)이라고 한다. hnRNP 단백질들은 histone과 함께 핵에 존재하는 단백질 중에서 그 수가 가장 많은 단백질이며, 30가지 이상이 알려져 있고 hnRNP A1에서 hnRNP U까지로 명명되어있다. hnRNA-hnRNP complex는 핵의 구조를 이루는 중요한 요소 중의 하나이며 hnRNP 단백질은 RNA에 결합하여 RNA의 안정화에 기여한다. hnRNP 단백질들 중에는 핵에만 머무는 단백질 뿐 아니라 핵과 세포질을 왕복하는 활성을 지니고 있는 단백질들도 있다. hnRNP A1은 320개의 아미노산으로 구성되어있고, 2개의 RNP-consensus RNA-binding domain과 Gly-rich domain을 가지고 있다. Gly-rich domain 안에는 RGG box와 M9 domain이 들어있다. hnRNP A1은 핵과 세포질을 왕복하는 기능이 있다. 또한 mRNA의 export를 돕고, cytoplasm에서의 기능이 있다는 것이 제시되었다. 본 연구에서는 hnRNP A1의 기능을 조사하기 위하여 yeast two-hybrid system을 사용하여 HeLa cDNA library와 human liver cDNA library에서 발현된 단백질 중 hnRNP A1과 상호 결합하는 단백질을 조사하였다. 그 결과 Karyopherin β2 (transportin), hnRNP F, RFP (ret finger protein), pyruvate kinase 등을 찾았다. 그 중에서 hnRNP F와 RFP에 초점을 맞추어 hnRNP F와 hnRNP A1 그리고 RFP와 hnRNP A1이 단백질-단백질 간에 상호 결합하는지를 조사하였다. hnRNP F와 RFP가 hnRNP A1과 단백질-단백질 간에 상호 결합한다면 두 가지 reporter gene인 lacZ gene과 his3 gene이 발현될 것을 예상하였는데, 두 가지 reporter gene이 발현된 것으로 보아 hnRNP A1은 RFP 그리고 hnRNP F와 단백질-단백질 간에 상호결합을 하여 hybrid transcriptional activator로 작용한다는 것을 알 수 있었다. 이 결과는 hnRNP A1이 hnRNP F 그리고 RFP와 yeast two-hybrid system에서 단백질-단백질 간에 상호결합을 한다고 제시한다. in vitro에서도 hnRNP A1이 RFP 그리고 hnRNP F와 단백질-단백질 간에 상호작용을 하는지 조사하였다. RNA가 단백질-단백질 간에 매개로 작용할 가능성을 배제하기 위하여 RNase A를 처리한 후 in vitro GST pull-down assay를 수행한 결과, hnRNP F와 RFP가 hnRNP A1과 RNA의 매개가 아닌 단백질-단백질 간에 상호 결합을 한다는 것을 짐작할 수 있었다. 본 연구에서 얻은 in vivo 및 in vitro assay를 이용한 실험 결과를 토대로 볼 때 hnRNP A1은 hnRNP F와 complex를 이루고, 또한 세포내에서 다양한 기능이 있다는 것을 제시한다.


    Heterogeneous nuclear RNAs (hnRNAs) are synthesized by RNA polymerase II in the nucleus of eukaryotic cells. Some of them are processed as mRNAs. HnRNAs are bound to large set of proteins and an RNA-protein complex is formed. These proteins are called heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNPs). HnRNPs are abundant nuclear protein. There are over 30 hnRNPs in human cells, which are termed hnRNP A1 through hnRNP U. hnRNA-hnRNPs complexs are important component of nuclear structure. HnRNPs contribute to the stability of RNA. HnRNP A1 is composed of 320 amino acid residues and contains two loosely conserved RNP consensus RNA binding domain and Gly rich domain. The Gly rich domain has RGG boxes and M9 domain. HnRNP A1 shuttles between the nucleus and cytoplasm. Also hnRNP A1 was suggested to play important roles on cytoplasmic functions. To investigate the functions of hnRNP A1, we searched for hnRNP A1-interacting proteins in HeLa cDNA library and human liver cDNA library using the yeast two hybrid screening system. The proteins expected to interact with hnRNP A1 are karyopherin β2 (transportin), hnRNP F, RFP (ret finger protein), and pyuvate kinase. We investigated protein-protein interactions between hnRNP A1 and hnRNP F and between hnRNP A1 and RFP. It was determined by monitoring β-galactosidase activity and viability histidine minus plates. The result indicated by β-galactosidase activity and by growth of the yeast transformants in histidine-deficient medium. These results suggest that hnRNP A1 specifically interact with hnRNP F and RFP in yeast two-hybrid system. Analysis of protein-protein interaction between hnRNP A1 and hnRNP F and between hnRNP A1 and RFP were performed using in vitro GST pull-down assay. The result suggest that hnRNP A1 specifically interact with hnRNP F and RFP without the bridge of RNA. In this study, in vivo and in vitro assay results suggest that hnRNP A1 form complex with hnRNP F and involved in a variety of function in the cell.


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