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Molecular Cloning, Expression and Characterization of Superoxide Dismutase Gene from Cordyceps militaris : Cordyceps militaris로부터 Superoxide dismutase 유전자의 클로닝, 발현 및 특성 원문보기

  • 저자

    박남숙

  • 학위수여기관

    東亞大學校 大學院

  • 학위구분

    국내박사

  • 학과

    농생물학과

  • 지도교수

  • 발행년도

    2004

  • 총페이지

    ix, 95p.

  • 키워드

    Superoxide dismutase 유전자 농생물학 클로닝 Cordyceps militaris;

  • 언어

    eng

  • 원문 URL

    http://www.riss.kr/link?id=T10067251&outLink=K  

  • 초록

    동충하초의 일종인 Cordyceps militaris로부터 항산화 효소로 알려져 있는 superoxide dismutase 유전자의 클로닝, 발현 및 특성에 관한 연구를 하였다. 본 연구를 위하여 채집한 Cordyceps의 5종과 한 종의 Paecilomyces tenuipes로부터 ITS와 5.85 rDNA의 염기서열을 분석하여 종간의 차이를 비교하였다. 이들의 ITS과 5.8S, ITS2의 전체 염기쌍의 길이는 528 bp에서 549 bp였다. 우리나라에서 채집한 C militaris의 염기서열을 기준으로 했을 때 C. pruinosa는 88,4%, C sphecocephala는 88.6%, C. scarabaeucika는 91.1%의 상동성을 보였다. 그리고 P.tenuipes는 86.8%의 상동성을 보여 다른 Cordyceps속보다는 분자계통학적으로 거리가 먼 것으로 나타났다. 또한 C. militaris의 지리학적 변이를 알아보기 위하여 우리나라의 두 지역에서 채집한 6개체와 중국에서 채집한 2개체와 GenBank에 등록되어 있는 일본과 중국의 C. militaris의 염기서열을 비교하였다. 우리나라와 일본, 중국 세 지역의 C. militaris의 ITS의 전체 염기쌍 길이는 528 bp로 모두 동일하였으며 염기서열을 비교했을 때 0.2% (1 bp)에서 0.4% (2 bp)의 차이를 나타냈다. 분자수준에서 C. militaris의 유전정보를 이해하기 위하여 C. militaris의 cDNA library를 제작하였으며, 이로부터 항산화 효소인 Cu,Zn superoxide dismutase (SOD1)을 암호하는 cDNA를 클로닝하였다. C. militaris SOD1 cDNA는 462 bp로서 154개의 아미노산으로 구성되어 있었다. C. militaris의 SOD1의 아미노산 서열은 Claviceps purpurea SOD1과 88%의 상동성을 나타냈고 다른 곰팡이에서 알려진 SOD1과도 64∼82%의 높은 상동성을 보였다. C. mi1itaris SOD1 유전자의 아미노산 서열을 밝혀 계통학적 분석을 해 본 결과 곰팡이의 일종인 자낭균에 속하는 것을 확인되었다. Genomic DNA 의 Southern blot 분석에서 C. mi1itaris의 SOD1 유전자는 단일 유전자로 존재하였고, Northern blot 및 Western blot 분석에서 C. mi1itaris가 성장할수록 SOD1 발현량이 증가됨을 확인하였다. 또한 C. mi1itaris SOD1의 효소 활성검정에서도 C. mi1itaris가 성장함에 따라 SOD1의 활성이 증가함을 확인하였다. C. mi1itaris의 SOD1 cDNA는 베큘로바이러스 발현 벡타 시스템 을 이용하여 Sf9 곤충세포주에서 발현하였다. 그 결과 C. mi1itaris SOD1은 약 17 kDa의 polypeptide로 발현되었다. 발현된 재조합 C. mi1itaris SODI 을 분리·정제하여 효소활성을 측정한 결과, 재조합 SOD1 1 mg당 약 568 U의 활성을 나타냈다. 또한 C. mi1itaris, P. tenuipes 및 Paecilomyces sp.의 SOD1 유전자의 genomic DNA 염기서열과 exon-intron의 구조를 밝혔다. C. mi1itaris와 P. tenuipes SOD1 유전자의 길이는 각각 922 bp와 966 bp였고, 154개의 아미노산으로 구성되어 있었으며, 3개의 intron과 4개의 exon으로 이루어져 있었다. C. mi1itaris 와 P. tenuipes에서 3개의 intron이 명확하게 구분되었고 exon은 13, 332, 97, 20 bp로서 각 exon 길이는 서로 동일하게 나타났다. Paecilomyces sp.의 SOD1 유전자의 길이는 946 bp였고 154개의 아미노산으로 구성되어 있었으며 4개의 intron과 5개의 exon으로 이루어져 있었다. Paecilomyces sp. SOD1 유전자의 5개의 exon은 13, 180, 152, 97 및 20 bp로 구성되어 있었으며, 흥미롭게도 이 결과에서 Paecilomyces sp. SOD1 유전자의 exon2 (180 bp)와 exon3 (152 bp)의 길이는 C. mi1itaris SOD1과 P. tenuipes SOD1 유전자의 exon2의 길이 332 bp와 동일하게 나타났다. C. mi1itaris SOD1의 아미노산 서열은 P. tenuipes의 SOD1과 95%의 높은 상동성을 보였고 Paecilomyces sp. SOD1과는 78%의 상동성을 보였다. C. mi1itaris SOD1, P. tenuipes SOD1 및 Paecilomyces sp. SOD1 유전자의 아미노산 서열을 이용한 분자계통분석에서 모두 자낭균에 속하는 것을 확인했다.


    The sequences of the internal transcribed spacers (ITS1 and ITS2) and 5.8S ribosomal DNA gene from five Cordyceps species and one Paecilomyces tenuipes were determined. The total length of the ITS1, 5.8S and ITS2 regions ranged from 528 to 549 bp. When the C. militaris collected from Korea was used as a standard genotype, the sequence showed 88.4%, 88.6%, 91.1% and 86.8% identity to C. pruinosa, C. sphecocephala, C. scarabaeucika and P. tenuipes, respectively, while the lowest identity was found with C. sinensis (75.4%). Interestingly, C. sinensis was phylogenetically distant from the other Cordyceps species. To test geographic variation, furthermore, sequences of the ITS regions in the 8 samples of C. militaris collected from two localities in Korea and China analyzed and compared with the GenBank-searched sequences from Japan and China. The total length of the ITS regions of C. militaris from Korea, Japan and China was completely identical to each other with 528 bp, and the sequence divergence among three localities in pairwise comparisons ranged from 0.2% (1 bp) to 0.4% (2 bp). A cDNA encoding the Cu,Zn superoxide dismutase (SOD1) of Cordyceps militaris was cloned. The SOD1 cDNA contains an open reading frame of 462 bp encoding 154 amino acid residues. The deduced amino acid sequence of the C. militaris SOD1 cDNA showed 88% identity to Claviceps purpurea SOD1 and 82% - 64% to other fungi SOD1. Phylogenetic analysis further confirmed that the deduced amino acid sequences of the C. militaris SOD1 gene belonged to the ascomycetes group within the fungal clade. Southern blot analysis of genomic DNA suggested the presence of the C. militaris SOD1 gene as a single copy and Northern blot analysis confirmed strong SOD1 transcript signal with growth stage. Similarly, the C. militaris SOD1 enzyme assay exhibited increment of activity with growth stage. The cDNA encoding C. militaris SOD1 was expressed as a 17 kDa polypeptide in baculovirus-infected insect Sf9 cells and the enzyme activity of the purified recombinant C. militaris SOD1 expressed in baculovirus-infected insect cells was approximately 568 U per mg of recombinant SOD1. The complete nucleotide sequence and the exon-intron structure of the Cu,Zn superoxide dismutase (SOD1) gene of Cordyceps militaris, Paecilomyces tenuipes and Paecilomyces sp. are described. The SOD1 gene of C. militaris and P. tenuipes spans 922 bp and 966 bp, respectively, and consisted of three intrans and four exons coding for 154 amino acid residues. Three unambiguous intrans in C. militaris and P. tenuipes separate exons of 13, 332, 97, and 20 bp, all exhibiting exon sizes identical to each other. The SOD1 gene of Paecilomyces sp. contains 946 bp and consisted of four introns and five exons coding for 154 amino acid residues. Five exons of Paecilomyces sp. SOD1 are composed of 13, 180, 152, 97, and 20 bp, and interestingly, this result showed that the total length of exons 2 (180 bp) and 3 (152 bp) of Paecilomyces sp. SOD1 is same to exon 2 length (332 bp) of C. militaris SOD1 and P. tenuipes SOD1. The deduced amino acid sequence of the C. militaris SOD1 showed 95% identity with P. tenuipes SOD1 and 78% with Paecilomyces sp. SOD1. Phylogenetic analysis confirmed that the C. militaris SOD1, P. tenuipes SOD1 and Paecilomyces sp. SOD1 are placed together within the ascomycetes group of fungal clade.


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