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Liquid Ordered State of Detergent Resistant Lipid Rafts is Maintained at Physiological Condition 원문보기

  • 저자

    김기범

  • 학위수여기관

    School of Life Science & Biotechnology Korea University

  • 학위구분

    국내박사

  • 학과

    Department of Life Science & Biotechnology

  • 지도교수

  • 발행년도

    2004

  • 총페이지

    53p.

  • 키워드

    Detergent Resistant Lipid Rafts Physiological Condition Liquid Ordered State;

  • 언어

    eng

  • 원문 URL

    http://www.riss.kr/link?id=T10068056&outLink=K  

  • 초록

    Lipid Raft란 세포막에 존재하는 cholesterol, sphingolipid-rich micro domain으로서, 다양한 신호전달 물질이 모이게 되는 signaling platform의 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 특이구조의 존재는 insulin signaling, cholesterol-homeostasis 등의 다양한 signaling event 들이 세포 내에서 보다 효율적으로 매개, 조절되는 것을 가능하게 하며, 이를 뒷받침하는 다양한 연구결과들이 보고되어 있다. 반면, 연구를 위한 이들의 분리정제 방법에 있어서 여러가지 논란이 야기되고 있는데, 그 중 가장 큰 논란이 되는 점은 이들의 분리가 세포막의 구성분간의 결합양상을 변질 시킬 수 있는 4C˚ 에서 이루어진다는 것이다. 또한 분리에 사용되는 Detergent에 따라서 raft내의 단백질 조성이 다르게 나타나는 사실 또한 관련 연구진행의 난점으로 지적되고 있다. 상기 주제에 대한 연구를 위해, HepG2 cell line내에 존재하는 raft 의 분리 정제를 다양한 방법을 통해 진행하였으며, 각 방법을 통해 추출한 raft들로부터 내부의 단백질만을 분리한 뒤, 이차원 전기영동을 통해 각각의 분리 방법에 따른 단백질 profile들의 차이점을 비교 분석하였다. 그 결과, 현재 이용되고 있는 TX-100를 사용한 raft의 저온 (4C˚)분리 법에 비해, brij35를 이용한 분리방법이 보다 많은 raft protein들을 보존시키고 있음을 확인하였다. 또한 2차원 전기영동 결과를 토대로 raft에 존재하는 lipid modified 단백질들인 Ras, Src, Fyn들의 western blot을 수행한 바, 기존의 보고와는 달리 저온의 분리조건에 비해 생리활성 조건인 37C˚ 에서 정성적으로, 정량적으로 더 많은 raft protein들이 안정화 되어있다는 사실을 알 수 있었다. 이와 같은 방법으로 분리한 raft 단백질들은, raft내의 cholesterol 을 제거 시킴에 따라 대부분 raft로부터 분리되는 양상을 보였으며, 이를 통해 Brij 35을 이용한 생리활성조건에서의 분리결과가 외부 단백질의 contamination에 의해 야기된 것이 아님을 증명할 수 있었다. 반면 detergent를 이용하지 않고, 세포막의 pH변화를 야기시켜 raft를 분리시키는 Detergent Free 방법의 경우, 다수의 protein들이 cholesterol 제거 시 별다른 영향을 받지 않은 체, raft에 그대로 상존하였는데, 이러한 결과는 상기의 분리법이 raft의 연구에 적절치 않을 수도 있음을 암시하는 것으로 볼 수 있을 것이다. 이들 연구결과를 종합해 볼 때, raft의 고유한 liquid-ordered structure는 생리 활성조건에서도 유지가 될 수 있으며, Brij 35를 이용한 raft의 분리방법이 기존의 방법에 비해 보다 정확한 raft의 연구를 가능케 한다는 결론을 내릴 수 있었다.


    Different proteins were found in lipid rafts depending on their isolation methods. For example, more insulin receptor was found in raft fractions prepared from HepG2 cells with Brij35 than with Triton X-100. In order to assess the effect of detergent type and temperature on raft isolation, raft proteins from HepG2 cells were analyzed by two-dimensional electrophoresis. More raft protein spots appeared when rafts were isolated by Brij35 at room temperature or 37℃ than by Triton X-100 at 0℃, indicating that lipid rafts are not disrupted in the presence of detergent at physiological temperature (37℃). Indeed, lipid-modified proteins such as Ras, Src, and Fyn were found in raft fractions although detergent-resistant rafts were isolated at room or physiological temperature. The 2-D gel profile of raft proteins isolated by detergent-free (high pH/carbonate) method was considerably similar to that of detergent-resistant raft proteins but showed more raft proteins. Whereas many detergent-resistant raft proteins disappeared upon cellular exposure with methyl-β-cyclodextrin, high pH/carbonate-resistant raft proteins did not, suggesting that many proteins isolated by high pH/carbonate could be contaminants. Taken together all these data, we conclude that liquid-ordered state of detergent-resistant lipid rafts are not destroyed at physiological temperature.


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