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B16F10 세포주에서 N-acetylphytosphigosine과 C_(2)-ceramide에 의한 Melanin 생성 억제 및 신호 기전 연구 원문보기
Activation of Akt/PKB at serine 473 by N-acetylphytosphingosine and C_(2)-ceramide reduce melanin synthesis in B16F10 mouse melanoma cells

  • 저자

    박미경

  • 학위수여기관

    同德女子大學校 大學院

  • 학위구분

    국내석사

  • 학과

    응용화학과 응용화학 전공

  • 지도교수

  • 발행년도

    2003

  • 총페이지

    v, 43p.

  • 키워드

    세포주 생성억제 신호기전 응용화학;

  • 언어

    kor

  • 원문 URL

    http://www.riss.kr/link?id=T10070305&outLink=K  

  • 초록

    Sphingolipid는 세포의 proliferation, differentiation, apoptosis의 조절과 함께 생명 현상의 중심에서 핵심적인 역할을 한다. 그러나 sphingolopid의 melanoma 세포에서 세포 성장과 melanogenesis에 미치는 영향에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 세포막을 투과할 수 있는 합성 sphingolipid로서 N-acyl기를 짧게 한, N-acetylphytosphingosine(NAPS)과 C_(2)-ceramide을 사용하여 B16F10 mouse melanoma 세포에서의 melanogenesis에 미치는 영향과 그의 신호전달 기전을 알아보고자 하였다. 먼저, NAPS와 C_(2)-ceramide의 생물학적 효과를 정량적으로 확인하기 위하여 세포생존율을 MTT assay로 조사한 결과 세포증식이 농도 의존적으로 억제되는 현상과 더불어 세포 분화가 유도됨을 보였다. 다음으로 melanin 합성 과정에서 중요한 역할을 하는 속도제한(rate-limiting) 효소인 tyrosinase의 activity를 측정한 결과, 처리 농도가 증가함에 따라 tyrosinase activity가 대조군에 비하여 모두 의미 있는 감소율을 보였다. Melanin 합성에 미치는 영향을 직접적으로 확인하기 위하여 최종 산물인 melanin의 양을 측정하였다. NAPS와 C_(2)-ceramide의 처리 농도가 증가함에 따라 melanin 양이 대조군에 비하여 점점 감소되었으며, 이 결과는 NAPS와 C_(2)-ceramide에 의하여 B16F10 melanoma 세포의 tyrosinase activity 변화와 매우 잘 일 치함을 보여준다. 더불어 tyrosinase와 tyrosinase 이후 과정에 작용하는 tyrosinase related protein-1(TRP-1)과 tyrosinase related protein-2 (TRP-2)의 mRNA 발현에 미치는 영향을 reverse transcription and polymerase chain reaction(RT-PCR)로 확인한 결과, tyrosinase, TRP-1과 TRP-2의 mRNA 발현에는 영향을 미치지 않았다 또한 tyrosinase의 protein 수준에도 영향을 미치지 않는다는 것을 western blotting으로 확인 하였다. NAPS와 C_(2)-ceramide를 처리하게 되면 세포의 성장이 억제되면서 세포 분화가 유도되고 tyrosinase activity를 감소시키므로 최종 산물인 melanin 합성이 억제되는 것으로 생각된다. 또한 tyrosinase activity는 억제 시키지만 tyrosinase의 mRNA와 protein 수준에 미치지 않는 결과를 볼 때 tyrosinase의 전사후 과정에 영향을 미칠 것으로 생각된다. Melanogenesis의 신호전달 기전이 밝혀지기 시작하여, cAMP-dependent protein kinase, protein kinase C-α(PKC-α), protein kinase C-β(PKC-β)와 mitogen-activated protein kinase(MAPK)등이 melanogenesis의 신호전달 기전에 관련이 있음이 밝혀졌다. 최근에는 phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K)와 Akt/protein kinase B(PKB)의 관련성이 제시되고 있다. NAPS와 C_(2)-ceramide의 신호전달 기전을 확인하기 위하여, Akt/PKB의 활성화에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과, Akt/PKB의 serine 473의 인산화가 NAPS 처리 후 5 min에서 급격히 감소하였다가 서서히 시간에 따라 증가하였으며, 1 hr부터는 대조군보다 증가하여 7 hr까지 계속 증가하였다. C_(2)-ceramide에 의한 Akt/PKB의 serine 473의 인산화는 5 min부터 대조군보다 인산화가 증가되어 7 hr까지 시간에 따라 점점 증가하였다. 더불어 Akt/PKB의 upstream인 PI3-K의 inhibitor인 LY294002를 처리하여 melanin 함량을 측정한 결과, LY294002에 의해 melanin 양이 대조군에 비하여 증가하였다. 또한 LY294002가 Akt/PKB의 신호전달 기전을 저해하는지를 확인한 결과, LY294002에 의하여 Akt/PKB의 serine 473의 인산화가 감소되었다. 이러한 결과로부터, NAPS와 C_(2)-ceramide가 Akt/PKB의 serine 473을 활성화시킴으로써 B16F10 mouse melanoma 세포의 melanin 합성을 저해한다는 사실을 알 수 있었다. 즉, NAPS와 C_(2)-ceramide의 경우에 모두, Akt/PKB의 활성화가 melanogenesis의 신호전달 기전에 관련이 있음을 시사한다.


    Sphingolipid metabolites regulate many aspects of cell proliferation, differentiation and apoptosis. However, there have been few investigations about the effects of sphingolipid on the growth and melanogenesis of melanoma cells. In the present study, we assessed the effect of N-acetylphytospingosine (NAPS) and C_(2)-ceramide on the depigmentation of mouse B16F10 melanoma cells and the possible signaling pathway involved. MTT proliferation assay showed that NAPS and C_(2)-ceramide inhibited the growth of B16F10 melanoma cells in a dose-dependent manner. We next observed the effects of NAPS and C_(2)-ceramide on the pigmentation of the melanoma cells. The melanin contents of the cells were significantly reduced by NAPS and C_(2)-ceramide at concentrations in the range of 1-5 μM. We also examined the tyrosinase activity using L-Dopa as a substrate and the results showed that tyrosinase activity of cell extracts was inhibited in a does-dependent manner. However the mRNA level of tyrosinase as well as that of tyrosinase related protein-1 (TRP-1) and tyrosinase related protein-2(TRP-2) genes were not affected by NAPS and C_(2)-ceramide based on a reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay. We also performed a western blotting analysis using anti-tyrosinase antibody. It showed that there is no change in tyrosinase protein level after treatment of NAPS and C_(2)-ceramide. These results suggest that the depigmenting mechanism of NAPS and C_(2)-ceramide in B16F10 melanoma cells involve inhibition of melanosomal tyrosinase activity, rather than the mRNA expression and protein level of tyrosinase. To identify the signaling pathway of NAPS and C_(2)-ceramide, we studied the ability of NAPS and C_(2)-ceramide to influence Akt/PKB (protein kinase B) activation. The phosphorylation of Akt/PKB at serine 473 by NAPS was dramatically decreased at 5 min, and then gradually increased up to 7 hr in a time-dependent manner. On the other hand, C_(2)-ceramide increased the phosphorylation of Akt/PKB at serine 473 in a time-dependent manner. In addition, the specific inhibitor of Akt/PKB activation by LY294002 increased melanin synthesis. We next wanted to determine whether LY294002 inhibits Akt/PKB activation in B16F10 melanoma cells, and indeed LY294002 was found to block Akt/PKB signaling in NAPS and C_(2)-ceramide treated cells and in normal cells. These results imply that the activation of Akt/PKB at serine 473 is related to the suppression of melanin production in B16F10 mouse melanoma cells.


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