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Optimization for the Production of 5-Aminolevulinic Acid by Immobilization of Transformed E. coli Cell 원문보기

  • 저자

    김무신

  • 학위수여기관

    고려대학교 대학원

  • 학위구분

    국내박사

  • 학과

    식품공학과

  • 지도교수

  • 발행년도

    2004

  • 총페이지

    ⅸ, 63p.

  • 키워드

    5-Aminolevulinic Acid Immobilization Cell;

  • 언어

    eng

  • 원문 URL

    http://www.riss.kr/link?id=T10070417&outLink=K  

  • 초록

    5-aminolevulinic acid (ALA)는 모든 생물계에서 Heme, Bacteriochlorophyll, corrinoid 등 Tetrapyrrole 화합물의 주 전구 물질로써, 태양광선에 의해서 강력한 산화 물질인 pchlide가 형성되고, 이 물질에 의한 일련의 산화 산응이 일어나 쌍자엽식물에게만 선택적으로 잎의 인지질을 파괴하여 고사시키는 photodynamic 물질이다. 그러므로, ALA는 사람과 동물 그리고 농작물에는 피해를 주지 않으면서 잡초를 선택적으로 고사시키므로 환경친화성 제초제로서 보고되고 있다. 또한, ALA는 이러한 제초제로서 뿐만 아니라 낮은 농도에서 사용할 때 식물 광합성의 증진, 호흡의 저해 및 CO₂의 동화를 촉진시켜서 성장을 촉진시키는 효과가 있다. 그밖에 ALA는 피부암 치료제 및 미생물 저항성 약품 등 의학 분야에서도 생물 활성 물질로 사용될 수 있다고 보고되어 있는데 특히 여러 종류의 악성종양 치료를 위한 photodynamic theraphy(PDT)의 photosinsitizer로서도 광범위하게 이용될 수 있는 것으로 밝혀져서 활발한 연구가 진행 중이다. 현재 ALA는 복잡한 유기 합성법을 이용하여 생산하고 있으나, 생산단가가 높아 채산성이 없으므로, 미생물의 발효를 이용한 ALA의 생산법 및 그 이용에 관한 특허들이 속속 출원되고 있다. 본 연구실에서는 유전공학을 이용하여 ALA 생성 균주 중 하나인 Bradyrizobium japonicum의 ALA synthase gene을 cloning 한 E. coli에서 발현시킨 균주를 효율적인 ALA 생산을 높이기 위한 실험을 하였다. 본 연구는 ALA의 연속적인 높은 수율을 위해 immobilized cell을 만들어 가능성을 타진하였다. ALA 생산 가능한 균주가 fermentation 동안에 높은 화학적 안정성을 받을 수 있고 균주가 mild한 조건하에서 prerequisites를 가능하게 함으로써 연속적인 fermentation에 의한 ALA수율의 높이는 것이다. 이번 연구에서는 두 가지 focus을 가지고 실험되었다. 하나는 immobilized cell을 만드는 최적조건 확립과 다른 하나는 fermentation 동안에 experimental parameters의 최적조건 확립이었다. 우선, immobilized cell을 만드는 과정에서 alginate의 농도, calcium chloride의 농도, gel 형성 후 경화시간에 따른 ALA의 농도, 균체의 농도, 균체의 viability를 측정하여 조건을 최적화하였다. 2% alginate, 0.2M calcium chloride와 최소 12시간의 경화시간을 거친 후 제조한 microbeads에서 단위시간당(24시간 fermentatin 후) 가장 높은 수율의 ALA가 생산(1.6/ℓ)되었고, 많은 균주가 살아있었다 (by SEM). 두 번째로, 이렇게 제조한 microbeads를 가지고 main culture을 하기위해 fermenter(2.5ℓ)로 옮겨 실험하였다. 여러 범위의 초기 균 수, microbeads 양, 온도, 공기의 양, pH에서 실험을 수행하였다. 0.7(A600에서 측정)의 초기 균 수, 50㎖의 microbeads, 37℃, 30%의 공기의 양, pH6.3의 범위 내에서 최적의 ALA 생산량(1.9/ℓ)을 보였다. 여러 번의 fermentation 동안에 microbeads의 안정성을 측정하였는데, 각 과정별로 유사한 ALA의 양이 측정되었다. Microbeads의 안정성과 균의 생존을 측정하기 위해 SEM을 이용하여 microbeads의 외부와 내부의 형태상을 관찰하였다. Fermentation전에는 외부와 내부면에 작은 pore가 형성되어있고, E. coli가 포집되어 있었다. Fermentation후에는 전보다 bead의 표면이 약간의 degradation이 일어났고, 포집된 E. coli들이 성장해서 밀집되어 있었다. 이상의 결과로 ALA의 연속적인 생산을 위해서 immobilized cell을 이용 가능성이 타진되었고, continous한 bioreacter를 제작함으로써 연속적인 배양이 가능할거라고 사료된다.


    The repeated production of 5-aminolevulinic acid (ALA) from immobilized cell (recombinant E. coli) was investigated. In this study, the production of ALA on a small scale by using flask(250㎖), and on a large scale by using a fermenter(2.5ℓ), cell concentration, and cell viability under several experimental conditions were established. In addition, various factors which affected the stability of calcium-alginate gel beads entrapping viable cells during fermentation were observed. It was found that the concentration of soduim-alginate, and calcium-chloride, and the hardening time after bead formation were most important factors affecting the stability of the gel beads during fermentation. In batch fermentation, the optimum conditions for the concentration of sodium-alginate, calcium chloride, and hardening time after beads formation were 2%, 0.2M, and for at least 12hr, respectively. Also, the experimental data to find optimun cultural conditions for 5-aminolevulinic acid production by immobilized cell were examined. The ALA production was tested at various initial cell concentrations(from O.D 0.3 to 0.9), temperature(from 33 to 40℃), bead volume (from 30 to 100ml/L medium), aeration (from 1 to 4L/min^(-1)) and pH(between pH6 to pH7). The pH was maintained by adding buffers. ALA production was highest (1.9g/L) at O.D 0.7 of initial cell concentration, at 37℃ with bead volume of 50ml/L of medium, 3L/min^(-1) aeration, and pH6.3. The morphology of the gel beads was evaluated using a scanning electron microscope, which showed before fermentation, small pores were found on the surface of beads and E. coli cells were entrapped inside the beads. After fermentation, it was shown that the surface of beads was partially degraded, and E. coli cells were grown to be packed inside.


 활용도 분석

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