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PC12 세포의 ERK2 핵 내 이동기전 및 세포반응에 따른 신호전달기전 연구 원문보기
Nuclear Translocation Mechanism of Extracellular Signal-Regulated Kinase2(ERK2) and Signal Transduction Mechanism upon Cellular Response in PC12 cells

  • 저자

    윤승희

  • 학위수여기관

    고려대학교 대학원

  • 학위구분

    국내박사

  • 학과

    생명공학과 분자생물학전공

  • 지도교수

  • 발행년도

    2004

  • 총페이지

    xi, 147p.

  • 키워드

  • 언어

    eng

  • 원문 URL

    http://www.riss.kr/link?id=T10070418&outLink=K  

  • 초록

    Extracellular signal-regulated kinases (ERKs)의 세포 내 위치와 ERK 활성화는 PC12 세포의 증식, 분화와 같은 세포 반응 조절에 중요한 기능을 한다. 특히 ERK2는 threonine 183과 tyrosine 185 잔기의 인산화를 통해 핵으로 이동이 일어난다. PC12 세포에서 ERK2의 위치를 추적하고자, 생화학과 세포 생물학에서 reporter로 많이 사용되는 Green Fluorescent Protein (GFP)에 ERK를 삽입시켜 GFP-ERK2 construct를 제조하여 사용했다. PC12 세포에 GFP-ERK2 construct만 주입 시 자극에 관계없이 세포 전체에 펴져 있으나, anchor의 역할을 수행하는 MEK1과 함께 주입하면, resting cell에서는 MEK1에 ERK2가 결합하여 세포질에 존재하나, 자극에 의해 서로 분리가 일어나 ERK2는 핵으로 이동된다. 그러나, 세포질에 존재하는 phosphatase인 MKP-3를 비활성화 형태로 만들어 GFP-ERK2와 함께 세포에 주입 시 자극에 상관없이 세포질에 존재한다. ERK2의 activation loop에 위치한 179-185 아미노산 잔기의 변형을 통해 ERK2의 세포 내 위치를 확인하였다. GFP-179A는 아미노산 잔기 179-181를 알라닌으로, GFP-183A는 아미노산 잔기 183-185를 알라닌으로 대체하였다. 변형된 GFP-ERK2 construct는 MEK1과 함께 PC12 세포에 주입 시 자극 유무에 관계없이 핵으로 이동이 일어나지 않는다. 이러한 변형은 자극에 의해 인산화 되는 기능이 없으며, 따라서 핵으로의 이동이 일어나지 않는다. GFP-ERK2를 PC12 세포에 주입 시키고 NGF를 72시간 처리하면 neurite outgrowth를 일으키나, 변형된 GFP-ERK2 construct (GFP-179A와 GFP-183A)는 neurite outgrowth가 일어나지 않는다. 그러므로 ERK2의 아미노산 잔기 179-185는 PC12 세포의 세포 내 위치 변화에 따른 세포의 분화에 중요한 역할을 수행한다. EGF에 의한 transient ERK 활성화는 PC12 세포의 증식을 유도한다. 그러나, c-Raf 활성화에 관여하는 p38MAPK 저해제인 SB203580은 ERK가 아닌 B-Raf의 sustained activation을 유도하는데 반해 SB203580과 EGF를 함께 처리 시에는 ERK와 B-Raf의 활성화를 장기화 시킨다. PC12 세포의 neurite outgrowth를 유도하는 낮은 농도의 SB203580은 MAPK activated-protein kinase-2 (MAPKAPK-2) 활성에는 큰 영향을 미치지 않는다. 그러므로 SB203580은 이미 보고 된 바와 같이 c-Raf 뿐 아니라, EGF와 함께 B-Raf의 활성화를 일으키므로 서 ERK의 sustained activation과 PC12 세포의 분화를 유도한다. 세포 또는 세포 추출물에서 ERK의 세포 내 이동을 관찰하기위해 GFP와 모세관 전기 영동장치 (Capillary Electrophoresis)를 이용한 방법을 개발하였다. PC12 세포에서 발현된 GFP-ERK2 단백질과 GFP vector 단백질을 검출하기 위한 최적의 조건은 uncoated fused silica capillary를 이용해 100mM SDS가 포함 된 pH 11의 100mM CAPS buffer를 20℃에서 실행 시 GFP vector 단백질은 3분, GFP-ERK2 단백질은 5분 안에 검출되었다. 뿐만 아니라, 위의100mM CAPS buffer에 2M betaine을 첨가한 조건 하에서는 인산화 반응이 일어나는 GFP-ERK2와 비 인산화 된 GFP-ERK2를 확인할 수 있으며 세포 내 위치에 따른 GFP-ERK2를 분석할 수 있다. 이러한 방법은 세포 내 구성물질의 위치 추적, 단백질과 단백질간의 상호 작용 뿐만 아니라 kinase 활성정도를 검출하는데 많은 이용 가능 하리라 본다.


    Proper subcellular localization of the extracellular signal-regulated kinases (ERKs) is important in regulating physiological functions in PC12 cells. ERK2 is phosphorylated on threonine 183 and tyrosine 185 residues, respectively, and then translocated from cytosol to nucleus. For the detection of ERK2 localization and activity in PC12 cells, Green Fluorescent Protein (GFP) as a reporter or labeling tag for gene expression commonly used in biochemistry and cell biology was used. GFP-ERK2 construct that cDNA of ERK2 was inserted into a variant GFP gene were transfected, and successfully expressed GFP-ERK2 into PC12 cells. The overexpression of GFP-ERK2 constructs without anchoring protein MEK1 showed overall distribution both the resting and the activated PC12 cells. While GFP-ERK2 coexpressed along with MEK1, cytosolic localization of GFR-ERK2 retained by MEK1 in the resting PC12 cells. This cytosolic retention was due to the binding of ERK2 to the MEK1. Upon stimulation by growth factors, the association between GFP-ERK2 and MEK1 was detached from each other and then GFP-ERK2 was translocated into the nucleus. However, inactive form of the MKP-3 cytosolic phosphatase forced the cytosolic retention of ERK2 in PC12 cells either without or with nerve growth factor (NGF) for stimulation. Regarding ERK2 subcellular localization in PC12 cells, the roles of residues 179-185 located in the activation loop of ERK2 were examined. The mutations were substitution of amino acids 179-181 by alanines (GFP-179A) and of amino acid 183-185 by alanines (GFP-183A). The mutated GFP-179A and GFP-183A in the activation loop showed different localization on the nuclear translocation of ERK2 in PC12 cells. The GFP-179A and GFP-183A cotransfected with MEK1 were unable to translocate into the nucleus both before and after stimulation with NGF. The mutants lack the ability to phosphorylate upon stimulation, and could not translocate into the nucleus. Therefore the residues 179-185 of ERK2 play a role in its subcellular localization in PC12 cells. Furthermore transient activation of ERKs by epidermal growth factor (EGF) induces proliferation in PC12 cells. The addition of SB203580, a p38MAPK inhibitor that has been implicated in the activation of c-Raf to PC12 cells causes the sustained activation of B-Raf but not of ERKs. The addition of SB203580 prolonged the transient activation of both B-Raf and ERKs by EGF alone. No significant change was detected in MAPK activated-protein kinase-2 (MAPKAPK-2) activity by at the low concentrations of SB203580, which induced neurite outgrowth in the EGF-stimulated PC12 cells. Therefore, but can also induce the activation of B-Raf, which in conjunction with EGF causes the sustained activation of ERK and differentiation in PC12 cells. Direct visualization method is necessary to observe localization of ERKs within the cell or in crude cellular extracts. A determination method was established for the detection of ERK2 localization in PC12 cells using GFP and capillary electrophoresis (CE) with laser-induced fluorescence (LIF). GFP-ERK2 proteins were detected within 5min by CE analysis using an uncoated fused silica capillary with LIF. Optimum conditions for GFP-ERK2 proteins detection were 100 mM CAPS buffer containing 100 mM SDS, pH 11, running at 20℃. Furthermore, a method to identify phosphorylation and translocation of GFP-ERK2 and GFP-183A proteins after stimulation aws developed. The state of the phosphorylation of GFP-ERK2 in migration time by CE-LIF was different, and jphosphorylated GFP-ERK2 proteins detected within 6min. Optimum conditions to detect phosphorylation form of GFP-ERK2 and GFP-183A proteins detection were 100mM CAPS buffer containg 2M betaine, pH 11, running at 20℃. This result offers new opportunity in screening for the determination of localization of intracellular components, protein-protein interactions and kinase activity within the cells using CE-LIF methods.


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