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Genetic Characterization of Mumps Viruses Isolated in Korea and Evaluation of Recombinant Proteins as a Diagnostic Reagent 원문보기

  • 저자

    이주연

  • 학위수여기관

    고려대학교 생명공학원

  • 학위구분

    국내박사

  • 학과

    생명공학과 생화학 전공

  • 지도교수

  • 발행년도

    2004

  • 총페이지

    ⅵ, 127p.

  • 키워드

    Mumps Viruses Recombinant Proteins Genetic Characterization;

  • 언어

    eng

  • 원문 URL

    http://www.riss.kr/link?id=T10070427&outLink=K  

  • 초록

    Mumps 바이러스는 Paramyxoviridae, Rubulavirus 속에 속하며, 혈청형은 한가지이나, 유전형은 small hydrophobic (SH) 유전자 특성에 의해 현재까지 A형에서 K형의 11가지 형으로 분류되고 있다. Mumps 감염증은 세계적으로 1970년 이후 백신의 도입으로 인해 발생률이 현저히 감소되어 왔으나 최근에는 백신 접종자에서까지 발생이 보고 되고 있다. 이렇듯 mumps가 임상적으로 중요하고 국내외에서 재유행하고 있음에도 불구하고 바이러스의 특성이나 transmission links에 대해서는 연구가 많이 이루어지지 않고 있다. 더욱이, 국내에서 사용 중인 enzyme immunoassay (EIA) 진단제는 대부분이 고가이고 시기적절한 공급에 어려움이 있어 mumps의 관리 및 예방에 문제점을 초래하고 있다. 따라서 본 연구에서는 1998년부터 2001년까지 국내에서 유행한 mumps 바이러스의 유전자중 주요 항원부위로 작용하는 hemagglutinin-neuraminidase (HN) 유전자와 가장 변이가 심한 부위인 SH 유전자, 그리고 전체 유전자에 대한 염기서열 분석을 실시하여 생물학적 특성과 관련된 유전적 특성을 조사하였다. 또한, mumps 바이러스에 특이적인 진단제 개발을 위해 nucleoprotein (NP) 유전자에 대한 재조합 단백질을 생산하여 진단제로서의 효능을 평가하였으며, polyclonal 혈청을 제조하여 면역원성을 확인하였다. 269개의 염기 및 57개의 아미노산에 해당하는 전체 SH 유전자 분석 결과 국내 분리주는 H와 I, 2개의 유전형으로 구분되었다. I형은 조사기간 동안 전국에서 지속적으로 발생하였으나, H형은 1999년에 한 지역에서만 발생한 것으로 나타났다. 염기 및 아미노산 분석 결과 I형 분리주는 중국에서 보고 된 F형과 가장 많은 차이를 보였으며 아미노산 28-30번째의 주요 motif를 포함하여 I형에만 특이적인 아미노산 변이를 갖는 것으로 나타났다. H형의 경우, 아시아와 유럽 지역 분리주들 간의 염기 및 아미노산 서열은 각각 2.3%에서 3.8% 및 3.6%에서 9.3%의 변이를 보여 국내 분리주를 포함한 아시아 지역 분리주는 유럽의 분리주와는 별개의 sublineage를 형성함을 확인하였다. 국내 분리주는 주요 표면 항원인 HN 유전자 분석에 의해서도 H와 I형, 2개의 유전형으로 분류되었으며, 다른 유전형과의 염기서열 비교시 type-specific 아미노산 변이를 보였으며 분리주들 간에도 매우 높은 유사성을 보였다. 더욱이, neutralizing epitope으로 알려진 329에서 340번째 아미노산과 9개의 glycosylation site를 포함한 주요 functional domains은 잘 보존되어 있어 HN 유전자에서의 evolutionary change는 없는 것으로 추정된다. 특히, HN 유전자중 virulence 관련 인자로 알려진 1,081번째 염기 및 335번째의 아미노산은 국내 분리주와 Urabe AM9 백신주 모두 기존의 보고에서와 같이 pathogenic form인 A 및 lysine으로 확인되었다. 이 위치에서의 아미노산 변이는 antigenic site의 charge를 변화시키고 이에 의해 virulence에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 또한 국내 분리주는 백신주와의 HN 유전자 염기서열 차이가 2.8%에서 8.5%로 유전적인 연관성이 없는 것으로 나타났다. 따라서 국내에서는 epidemics동안 mumps 바이러스 유전자내의 변이가 축적됨으로써 유전적으로 새로운 바이러스가 생성되어 유행한 것으로 추정된다. Mumps 바이러스의 유전자 분석은 antigenicity나 virulence와 같은 생물학적 특성과 관련된 기작 및 다양성 연구에 중요하다. 이에 국내 분리주의 전체 유전자 분석을 실시하여 그 특성을 조사하였다. 유전형 I에 속하는 Dg1062/Korea/98 분리주의 전체 유전자는 15,384개의 염기 및 7개의 단백질로 구성되어 있었다. 또한 rapid amplication of cDNAs ends (RACE) 방법을 이용하여 cis-acting sequence로 작용하는 5'와 3'양 말단이 각각 54, 24개의 염기로 되어 있음을 확인하였다. 다른 유전형과의 염기 서열 비교 결과 2.9%에서 6.8%의 divergence를 보였으며 보존적인 염기 서열을 중심으로 비교시 총 206개의 염기와 54개의 아미노산이 다른 것으로 나타났다. 유전자중에서는 NP 유전자가 가장 보존적인 반면 SH 유전자에서 가장 높은 변이를 보였다. 비록 본 연구에서는 structural motifs나 functional domains에 영향을 미치는 아미노산 변이가 확인되지 않았으나 생물학적 특성에 영향을 미치는 아미노산 변이가 있을 가능성은 배제할 수 없으리라 생각된다. 본 연구에서는 mumps에 특이적인 항원 진단제를 개발하기 위해 mumps 바이러스의 NP 유전자를 발현하여 이 재조합 단백질의 반응성 및 면역원성을 평가하였다. E. coli 내에서 발현된 complete NP 유전자의 histidine-tagged 재조합 단백질은 mumps 바이러스의 authentic NP와 유사한 약 66kDa의 밴드를 보였으며 파라인플루엔자바이러스, 파보 바이러스 B19, 홍역 및 풍진바이러스에 대한 교차반응도 없는 것으로 나타났다. 진단제로서의 효능을 조사하기 위하여 정상인 및 mumps 환자의 혈청을 이용하여 EIA를 실시하였다. Indirect IgM 시험 결과 민감도는 81.5%, 특이 도는 97.2%였으며 Indirect IgG 시험 결과 민감도는 65.0%와 특이 도는 88.5%였다. 이처럼 재조합 단백질 이용시 기존 진단제에 비해 민감도가 낮은 것은 재조합 단백질의 conformation이 적절하지 못하거나 정제 과정시 박테리아 구성 성분이 같이 유출되었기 때문인 것으로 추정된다. 또한 BALB/c mice를 이용하여 재조합 단백질에 대한 polyclonal antisera를 제조한 후 indirect fluorescence assay (IFA), Western blotting 및 EIA 방법으로 항원성을 확인하였다. 본 연구는 국내에서 유행한 mumps 바이러스의 유전적 다양성에 대하여 처음으로 보고하는 것으로 이들 바이러스는 epidemics동안 지속적인 유전자 변이 축적 및 적응을 통해 기존 바이러스와는 다른 유전형으로 진화해 왔음을 시사하고 있으며 이를 통해 mumps의 관리 및 감시에 유용한 정보를 제공할 수 있을 것으로 본다. 또한 mumps 바이러스의 유전적인 정보와 생물학적 기능과의 관계를 규명하는 기초 자료로 제시될 수 있으리라 본다. 더욱이, mumps 바이러스 재조합 NP 단백질이 진단용 항원제로서 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였고 이를 구조와 기능에 관한 연구 자료로 활용할 수 있으리라 생각된다.


    Mumps virus belongs to the genus Rubulavirus, family Paramyxoviridae. It is known to be monotype serologically, but is genetically classified into 11 genotypes named A to K based on the characteristics of small hydrophobic (SH) gene. Although the incidence of mumps has been considerably reduced due to the introduction of vaccine since the 1970s worldwide, recently outbreaks have been reported, even in the vaccinated populations. Despite the clinical significance and resurgence, little is known on the characteristics and epidemiological transmission links of mumps virus. Furthermore, most of enzyme immunoassay (EIA) kits used in Korea are imported, thereby, it is expensive and sometimes is not timely supplied to diagnose, leading to the problem in the control and prevention of mumps infection. Therefore, this study was performed to investigate the genetic characteristics in relation with the biological properties of mumps viruses circulated in Korea from 1998 to 2001 by analyzing sequences of the SH, hemagglutinin-neuraminidase (HN), and complete genome. Also, the recombinant nucleoproteins of mumps virus were expressed and evaluated reactivity and immunogenicity for the development of a diagnostic reagent. Phylogenetic analysis of the complete SH gene corresponding to 269 nucleotides (nts) and 57 amino acids (aa) revealed that Korean isolates were grouped into two genotypes, H and I. While genotype I was predominant throughout the country during this period, genotype H was detected in one region, 1999. The sequences of genotype I strains were most divergent from those of genotype F strains and had the type-specific amino acid changes including the signature motif at positions 28 to 30. Within genotype H, Asian and European strains differed from 2.3 to 3.8% and 3.6 to 9.3% at the nucleotide and amino acid level, respectively, implying that they should be considered as a distinct sublineage. Sequences analysis of the complete HN gene known to be the major surface protein showed that Korean isolates were also classified into two groups, genotypes H and I. Korean strains had a high homology with type-specific amino acid changes within each genotype. Furthermore, critical functional domains including neutralizing epitope at positions 329 to 340 and 9 glycosylation sites were conserved, implying that there was no evolutionary change in the HN gene. One of genetic changes associated with virulence in the HN gene was also examined. The wild-type mumps viruses and unpasassaged Urabe AM9 vaccine strain had an A residue at 1,081 that encoded a lysine at position 335 as previously reported, which may affect charge of an antigenic site and lead to the alteration of virulence. There was no genetic relationship between Korean isolates and vaccine strains with 2.8 to 8.5% difference in the nucleotide level of HN gene, suggesting the accumulation of sufficient point mutations during epidemics may lead to the emergence of genetically different virus. The genetic determination of mumps virus may be important to elucidate the mechanism and diversity related to the biological characteristics such as antigenicity and virulence. For this, molecular characteristics on the complete genome of Korean isolate was analyzed. The full-length genome of Dg1062/Korea/98 strain belonging the genotype I was 15,384 nts in length and encoded seven proteins. The both 5'- and 3' ends corresponding to cis-acting sequences were confirmed to be 55 and 24 nts, respectively, by rapid amplication of cDNAs ends (RACE) method. The divergence with other strains in the nucleotide level was 2.9 to 6.8% where the amino acid sequence for the NP was the most conserved, and that of the SH gene showed the highest variability. A total of 206 nt and 54 aa differences were found over the entire genome relative to the consensus sequences of other strains. Despite the sequence variations, it might be considered that this isolate had no significant variations affecting structural motifs or functional domains. However, the possibility of amino acid changes affecting viral phenotype still remains. To produce an alternative method to detect mumps-specific antibodies, the recombinant NP gene of mumps virus was expressed and its reactivity and immunogenicity were evaluated. The complete NP gene of mumps virus was successfully expressed in E. coli as a histidine-tagged recombinant protein with molecular weight (MW) of ∼66 kDa that was similar to the authentic viral protein in electrophoretic mobility. There were no cross-reactivities against other viruses such as parainfluenza virus, parvovirus B19, measles, and rubella viruses. Following purification, the proteins were applied to EIA against human sera previously diagnosed by a commercial kit. The indirect IgM assay showed the reactivity with 81.5% in sensitivity and 97.2% in specificity. For the indirect IgG assay, sensitivity and specificity were 65.0% and 88.5%, respectively. One possibility for lower sensitivity may result from incorrect conformation of the recombinant proteins or contamination of bacterial components during purificaiton. To check the immunogenicity of recombinant proteins, polyclonal sera were produced from BALB/c mice and confirmed to be reactive against recombinant as well as native antigen by indirect fluorescence assay (IFA), Western blotting, and indirect EIA. This is the first report on the genetic diversity including genotypes H and I of mumps viruses in Korea, which suggests that circulating viruses have been distinctly evolved through the accumulation of mutations and adaptation during epidemics, providing information on the control and surveillance of mumps virus. This can be also useful to elucidate the relationship between genetic information and biological function of mumps viruses. Furthermore, this result demonstrates that the recombinant nucleoproteins may be a suitable resource as a diagnostic reagent and useful in fundamental research concerning structure-function studies.


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