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Proteome Analysis of Halobacterium salinarum Cultured in Medium Containing Isopropanol 원문보기

  • 저자

    하동진

  • 학위수여기관

    고려대학교 생명공학원

  • 학위구분

    국내박사

  • 학과

    생명공학과 의약생명공학전공

  • 지도교수

  • 발행년도

    2004

  • 총페이지

    ⅳ, 47p.

  • 키워드

    Halobacterium salinarum Halophiles Medium Containing;

  • 언어

    eng

  • 원문 URL

    http://www.riss.kr/link?id=T10074232&outLink=K  

  • 초록

    Halophilic archaea는 여러 유기 오염원들을 분해 혹은 이에 적응하여 살아 갈 수 있는 능력이 있음이 알려졌다. 이들이 이런 환경에 적응하는 것은 호염성 세균만의 독특한 능력이 있기에 가능하며, 이런 과정에 연관되는 단백질과 그 경로를 유추해 보기 위하여 이 연구를 수행하였다. 여러 물질 중, Isopropyl alcohol(IPA) 첨가 시 호염성 균의 성장곡선은 최대 0.5%까지 성장함을 보였고, 여기서 IPA 첨가 시, 성장 시 사용 된 양과 그 중간 산물로 생성되는acetone의 양을 가스 크로마토그래피를 이용하여 측정하였다. 또한 0.5%에서 자란 호염균으로부터 단백질을 분리하여 2-DE 실험을 통해 단백질 발현 양상을 관찰하였다. IPA를 처리하지 않은 대조군과 비교하여 다르게 발현된 spots을 선택하여 ESI-Q TOF MS/MS 방법을 이용하여 단백질들을 동정하였다. 그 중 IPA metabolism과 관련 있는 GAPDH를 선정하였다. GAPDH는 glycolysis와 gluconeogensis에 중요한 역할을 하는 단백질로서, 0.5% IPA 첨가 시 증가하는 것을 확인하였다. 이를 규명하고자 Halobacterium sp. NRC-1의 염기서열을 바탕으로 primer를 제작하여 PCR을 수행하여, 약 1kb의 GAPDH 유전자가 존재함을 밝혀내었고, 이 단백질을 순수 분리하기 위하여, E. coli system에서 발현시켜 glutathione sepharose beads에 binding 시킨 후 thrombin protease를 처리하여 GAPDH를 분리하였다. 여기서 획득된 GAPDHD 효소 활성을 토끼 근육에서 정제 된 GAPDH와 비교, 측정해 본 결과 염이 없을 때도 그 활성(158.1±25.2μM/min/mg)이 나타났지만, 염이 존재할 때 더 높은 활성을 보임을 관찰하였다. 위의 결과로부터 극한 호염성 균인 Halobacterium salinarum이 IPA metabolism을 가짐을 유추할 수 있었고, 그와 관련된 단백질 중 GAPDH는 그 유전자가 NRC-1과 거의 유사하며 그 활성은 1 M 염 농도에서 최고치 (253.9±10.4μM/min/mg)를 보임을 확인하였다.


    Halophilic archaea have known to have capabilities to biodegrade several organic pollutants. Isopropyl alcohol(IPA) is a volatile solvent which is widely used in industry. An increase in its consumption creates serious problems in contaminating waste stream. To screen halophilic enzyme related to IPA degradation, H. salinarum grown under 0.5% IPA and the medium was analyzed with gas chromatography-flame ionization detector(GC-FID) to detect residual IPA. The different profile of protein expression in cell exposure to IPA was investigated using the two-dimensional electrophoresis(2-DE). The proteins which show differences in expression levelswere identified by electrospray ionization-quadropole-time of flight(ESI-Q-TOF) mass spectrometry. Among the identified proteins, glyceraldehydes3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was cloned into E. coli and purified. GAPDH was stable at the high salt concentration and showed the maximum activity at 1 M NaCl. Therefore, H. salinarum can degrade IPA and GAPDH from H. salinarum can be used at high salt concentration.


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