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Microfluidic chip-based high throughput screening system for RNA and enzyme targets 원문보기

  • 저자

    이지혜

  • 학위수여기관

    고려대학교 생명공학원

  • 학위구분

    국내박사

  • 학과

    생명공학과 생화학 전공

  • 지도교수

  • 발행년도

    2004

  • 총페이지

    ⅶ, 77p.

  • 키워드

    Microfluidic chip RNA Enzyme targets;

  • 언어

    eng

  • 원문 URL

    http://www.riss.kr/link?id=T10074240&outLink=K  

  • 초록

    미세 공정으로 제작된 소형화된 장치는 초고속 스크리닝과 신약탐색에 이용되는 생화학적 분석을 하기 위한 기반을 제공한다. 본 논문에서 제시하는 내용은 미세유체제어칩, 펌프, plate의 위치를 조절하는 조정장치 그리고 형광 검출 장치로 구성된 미세유체 초고속 스크리닝 시스템연구에 관한 것이다. 먼저 생화학 분석 방법을 개발하기 위해서 미세유체제어칩을 설계, 제작하였고, 유체 모의실험을 실시하였다. 미세유체 채널 안에서 일어나는 변화를 감지하기 위한 방법으로는 형광 강도나 형광 편광방법을 이용하였다. 제작한 칩과 검출시스템에서 초고속 스크리닝 시스템을 시험하기 위해서 RNA와 aminoglycoside의 결합반응과 효소반응을 선택하여 실험을 수행하였다. RNA와 aminoglycoside의 결합반응을 측정하기 위해서 형광 분광기를 이용하여 실험을 실시하였고, 효소 반응은 형광 분광기와 자외선 분광기를 이용하여 실험을 실시하였다. 이러한 실험을 제작한 칩을 이용해서 수행하기 위해서 유체의 속도와 완충용액의 조성을 최적화하는 실험을 먼저 수행하였다. 다음으로 RNA 분석을 하기 위해 제작한 형광물질이 부착된 aminoglycoside와 RNA를 칩의 저장소에 넣고 계속 흘려주며 반응시키고 plate에 담겨있는 화합물을 모세관을 통해서 흡입되도록 하였다. 효소 반응을 실험할 때는 효소와 기질을 각각 칩의 저장소에 넣고 앞의 실험과 같이 화합물이 모세관을 통해 흡입되도록 한다. RNA와 aminoglycoside의 결합반응이나 효소 반응이 화합물에 의해 변화하는 결과는 형광 강도의 변화나 형광 편광의 변화를 통해서 관찰하였다. 실제로 텔로머레이즈 RNA와 형광 물질이 부착된 파로모마이신인 CRP의 결합 반응을 미세유체제어칩에서 측정하였다. 텔로머레이즈 RNA와 CRP의 결합을 방해하는 화합물로는 네오마이신을 이용하였고 이들 간의 결합은 형광 강도와 형광 편광방법으로 관찰하였다. 효소 반응으로는 protein tyrosine phosphatase 1B 와 caspase-3를 이용하였고, 미세유체제어칩을 이용하여 각 효소의 Km 값을 구하고 화합물을 이용하여 효소반응이 저해되는 것을 관찰하였다. 본 연구에서 제작한 장치는 RNA에 대해 높은 결합력을 갖는 물질이나 효소에 대한 높은 저해능력을 갖고 있는 화합물을 초고속으로 스크리닝하는데 효과적으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.


    Microfabricated miniaturized devices provide useful platforms for sensing and conductingbiochemical assays for high throughput screening and drug discovery. The present work describes a microfluidic high throughput screening system, which is composed of a microchip, a hydrodynamic pumping unit, a handler for positioning well plates and fluorescence detectors. In order to develop biochemical assays, microchips were designed and fabricated on a glass substrate, and flow simulations in the micro-channels were performed. Fluorescence intensity and polarization havebeen used for probing reactions within microfluidic channels. In this study, RNA-aminoglycoside interactions and fluorogenic enzyme reactions were chosento test high throughput screening using the proposed device. Off-chip assays developments were performed by measuring the binding of RNA with aminoglycosides with a fluorescence spectrometer. In addition, enzyme assays were developed by detecting the signal with a UV spectrometer or a fluorescence spectrometer. To experiment on chip, flow rates and buffer compositions were optimized for fluorescence-based biochemical assays. Either a fluorescently-labeled aminoglycoside probe and RNA or a fluorogenic substrate and an enzyme were allowed to flow continuously to the main micro-channel, and chemicals in microplate were sequentially sipped via a capillary tubing usinghydrodynamic pumping. Their interactions were then monitored by fluorescence intensity or polarization changes, which were reversed upon competition betweenchemicals for the binding to RNA or an enzyme. Telomerase RNA and carboxytetramethlyrhodamine conjugated paromomycin(CRP) has been used to demonstrate microfluidic chip system. Neomycin was also used to compete with CRP for telomerase RNA. The interaction between telomerase RNA and CRP or neomycin was observed by fluorescence quenching or polarization. Protein phosphatase 1B(PTP1B) and caspase-3 was used to prove microfluidic chip system. The Km value of PTP1B and caspase-3 for substrate was determined using microfluidic chip. PTP1B and caspase-3 was inhibited by their inhibitor sipped through capillary. This device would serve as an integrated microfluidic platform for high throughput screening of high affinity antibiotics for RNA and inhibitors for enzyme.


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