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Development of Real-Time PCR and Monoclonal Antibody-Based ELISA for Detection of Clostridium botulinum Type A 원문보기

  • 저자

    윤소연

  • 학위수여기관

    고려대학교 생물공학원

  • 학위구분

    국내박사

  • 학과

    생명공학과 분자생물학 전공

  • 지도교수

  • 발행년도

    2004

  • 총페이지

    ⅳ, 53p.

  • 키워드

    Real-Time PCR Clostridium botulinum Antibody-Based ELISA;

  • 언어

    eng

  • 원문 URL

    http://www.riss.kr/link?id=T10074249&outLink=K  

  • 초록

    보툴리즘의 실험적인 진단은 최근까지 마우스 bioassay를 기초로 하였다. 보툴리눔균의 DNA 정량분석을 위한 분자적 접근 방법의 개발은 임상적으로 보툴리즘을 취급하는데 중요한 가치를 부여 하고 있다. 이 연구의 목적은 보툴리즘의 진단을 위한 새로운 기술들을 개발하는데 있다. 실시간으로 정량분석에 사용될 real-time PCR은 보툴리늄 독소의 유전자에 특이적으로 붙는 probe를 이용하여 보툴리눔균 type A의 DNA를 검출하는 방법으로 새롭게 개발되어졌다. 이 assay의 특이도는 임상적으로 분리된 보툴리눔균 type A와 표준균주 보툴리눔 type B, C, D, E, F를 포함한 10속의 20종 균을 사용하여 증명하였다. 그리고 이 assay의 민감도는 보툴리눔균 type A의 DNA와 포자를 각각 10배씩 단계 희석한 것을 사용하여 평가하였고 이 결과 보툴리눔균 type A의 DNA와 포자는 각각 0.1ng과 10²spore/ml까지 검출됨을 확인하였다. 이러한 assay의 민감도 평가를 위해 옥수수 통조림과 소시지 슬러리에 인공적으로 포자를 첨가하여 다음의 두 가지 방법인 열처리법과 GuSCN처리법을 이용하여 추출한 DNA를 사용하였다. 열처리된 음식물 내에서의 포자는 10³spore/ml에서부터 검출 되었다. 이러한 검출방법에서 음식물에서 포자 검출능력 효율성을 위해 guanidine isothiocyanate를 이용하여 추출한 DNA를 사용하였고, 그 결과 포자 검출력이 10²spore/ml까지 향상되었다. 또한 보툴리눔 독소 type A 검출을 위해 double-sandwich ELISA 방법에 단일클론항체를 사용하여 개발하였다. 이러한 방법을 위해 보툴리눔 신경독소 type A에 대한 4개의 단일클론항체를 제작하였고 모두 보툴 리눔 독소의 light chain에 반응하였다. 이러한 단일클론항체중 2E10과 3A1은 ELISA와 SPR에 의해 가장 높은 친화력을 보여주었고, 이 결과에 따라 두 단일클론항체를 double-sandwich ELISA 실험에 사용될 단일 클론항체로 선택하였다. 각각의 ELISA plate에 고정되어 보툴리눔 독소와 반응시킨 단일클론항체는 biotinylate화된 다클론항체와 반응시켰다. 이 assay의 민감도를 증가 시키기 위해서 효율적인 단일클론항체의 농도를 10μg으로 결정하였다. 이 효율적인 단일클론항체 농도를 사용하 여 double-sandwich ELISA가 수행되었고 보툴리눔 독소에 대한 검출정도는 5ng에서부터 이루어졌다. 본 연구에서 개발한 기술은 음식물과 임상적인 시료로부터 보툴리눔균 검출 방법으로 검진실험에 유용하게 이용 될 것이다.


    The laboratory diagnosis of botulism has until recently been based on mouse bioassay targeting botulinum toxin. The development of molecular methods allowing for the quantitation of the DNA of C. botulinum is proving clinically valuable for treatment. The aim of this study is to develop a new technique, for diagnosis of botulism. A new real-time quantitative PCR (real-time PCR) was developed for the detection of the DNA of C. botulinum type A based on sequence specific hybridization probes, targeting the botulinum toxin. The specificity of the assay was verified by using a C. botulinum type A clinical isolate and 10 genera of 20 strains including reference strains of C. botulinum types A, B, C, D, E, and F. The sensitivity of the assay was evaluated using 10-fold dilution series of DNA and spore from C. botulinum type A, respectively. The DNA and spore were detected up to the level of 0.1ng and 10²spores/ml, respectively. According to the results of the assay, the detection technique used real-time PCR was applied to spore spiked canned corn and sausage slurry by two DNA extraction methods (heat treatment and GuSCN). Using heat treatment, the detection limit of spores in food samples (canned corn, sausage) was 10³ spore/ml. In order to be efficient detection for spores in food sample, DNA extraction protocol using guanidine isothiocyanate was applied that enhanced spore detection limited to 10² spores/ml. Also, double-sandwich ELISA to detect toxin of C. botulinum type A was developed using monoclonal antibodies. Four monoclonal antibodies (MAbs) were produced against the botulinum neurotoxin type A (BoNT/A). They reacted to light chain of neurotoxin typeA by western blot. According to the results of ELISA and surface plasmon resonance (SPR) technology, MAb 2E10 and 3A1 had most high affinity and were selected for this assay. For this assay, the MAb was immobilized on ELISA plates for detecting BoNT/A that was coupled with biotinylated polyclonal antibodies. In order to increase sensitivity, amounts of MAb were optimized (10μg). Using the optimized concentration of MAb, double-sandwich ELISA assays detected BoNT/A as low as 5ng. These techniques developed in this study may serve as a useful screening test to detect of C. botulinum in food and clinical samples.


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