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Construction of a Stable Full-length cDNA clone of Japanese Encephalitis Virus using Low Copy Number Plasmid 원문보기

  • 저자

    추미성

  • 학위수여기관

    고려대학교 생명공학원

  • 학위구분

    국내박사

  • 학과

    생명공학과 분자의과학 전공

  • 지도교수

  • 발행년도

    2004

  • 총페이지

    ⅱ, 40p.

  • 키워드

    Low Copy Number Plasmid Japanese Encephalitis Virus cDNA clone;

  • 언어

    eng

  • 원문 URL

    http://www.riss.kr/link?id=T10074252&outLink=K  

  • 초록

    일본뇌염 바이러스 (JEV)는 Flaviviridae에 속하는 positive RNA 바이러스로 모기에 의해 매개되며 아시아지역에 매년 공식적으로 35,000명 정도의 일본뇌염 환자를 발생시키고 있다. 국내에서는 1946년 이래 매년 큰 유행이 있었으나 1983년 이후 Nakayama-NIH 주로 제조된 mouse brain 불활 화 백신의 전국적 사용으로 환자발생률이 급속히 감소하였다. 그러나 mouse brain 불활 화 백신은 mouse brain 조직을 배양하여 formaline 등으로 불활 화 시킨 후 정제하는 과정에서 중추신경계 단백질인 MBP (myelin basic protein)가 남아 있어 알레르기성 뇌수막염을 일으킨다. 하지만 최근에 개발된 생 바이러스 SA14-14-2주는 기존에 불활 화 백신과 유사한 항체유도가 가 확인되었으며, 제조공정의 단순화로인하여 생산단가를 낮추어 백신으로서의 사용은 경제적이다. 따라서 SA14-14-2주의 연구는 일본뇌염백신의 안정성 확립에 크게 이바지 하게 될 것이다. 하지만 이러한 연구에 있어서 필요한 일본뇌염 백신의 clone은 현재까지도 미비하며 특히SA14-14-2주에 대한 분자적인 구조연구에 필요한 clone은 아직까지 보고되지 않았다. SA14-1-4-2주의 clone의 제조에 있어 clone의 안정성과 copy 수가 중요한 인자로서 생산공정에 있어서 조작에 필요한 양을 얻기 위해서는 high-copy 수의 plasmid가 필요하다. 그러나 high-copy수의 plasmid 에서 만들어진 안적 적인 clone은 아직까지 연구단계이며 효모나 박테리오파지 등에서만 full-length infectious cDNA clone이 보고되고 있다. 이 연구에서 사용된 pACYC184 plasmid 의 경우 실험실에서 일반적으로 사용될 수 있고, 만들어진 cDNA를 안정적으로 유지해주며, 계 대간에 발생하는 돌연변이를 최소화 해준다.


    Japanese encephalitis virus (JEV) is a positive-stranded enveloped RNA virus that belongs to the family Flaviviridae. Genomic JEV RNA is approximately 11 kb and encodes 10 proteins, 3 structural and 7 nonstructural. Molecular genetic studies of JEV are hampered by the lack of a genetically stable full-length infectious JEV cDNA clone. This study is the successful construction of a stable full-length infectious cDNA clone of the live attenuated vaccine strain SA14-14-2. The viral RNA genome was reverse transcribed, amplified as four overlapping DNA fragments and successively ligated into the low copy number plasmid pACYC184, which contains the p15A origin of replication and stably maintained in E. coli strain. In vitro transcribed RNAs have a specific infectivity of 10⁴ PFU/g RNA and the resulting virus exhibited growth kinetics and plaque morphology similar to the parental virus in cell culture. It be useful as a heterologous gene expression vector and will aid the development of a vaccine against JEV.


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