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The effect of β_(3) integrin antisense for cellular entry hantavirus 원문보기

  • 저자

    김아영

  • 학위수여기관

    Korea University Graduate School

  • 학위구분

    국내박사

  • 학과

    Department of Medical Science

  • 지도교수

  • 발행년도

    2003

  • 총페이지

    viii, 80p.

  • 키워드

    β_(3) integrin antisense cellular hantavirus;

  • 언어

    eng

  • 원문 URL

    http://www.riss.kr/link?id=T10074263&outLink=K  

  • 초록

    한탄 바이러스(HTN), 서울 바이러스(SEO) 및 푸말라 바이러스(PUU)는 병원성 한타바이러스의 범주에 속하며, 신증후출혈열을 일으키는 감염원이다. 이러한 병원성 한타바이러스는 감염 주기의 세포 침입과정에 있어서 β_(3) integrin과 상호작용을 하는 것으로 보고되고 있다. 본 연구에서도 간접면역형광항체법을 사용하여 한타바이러스와 β_(3) integrin과의 상호작용을 확인하였다. 따라서, 한타바이러스가 세포 내로 칩입할 때 β_(3) integrin 내 각 영역별로 상호작용의 효과를 알아보기 위하여 β_(3) cDNA의 각기 다른 영역에 속하는 4개의 ansense (AS) 및 4개의 sense (S) construct들을 만들었다. β_(3) AS construct는 Vero E6 세포 내로, β_(3) S construct는 CHO 세포 내로 각각 도입(transfection)하였다. 실시간 역전사 중합효소 반응(real-time RT-PCR)을 이용하여 vRNA를 정량함으로써 바이러스 감염력(viral infectivity)을 분석하였다. 또, Western blot 분석(Western blot analysis)을 이용하여 한타바이러스를 감염시킨 세포 내의 바이러스 단백질(viral protein)의 발현양을 분석하였다. β_(3) AS construct 중 세 가지 construct이 β_(3) integrin의 세포 내 발현을 억제함으로써, 그 결과 병원성 한타바이러스의 세포 내 감염력이 AS construct를 도입하지 않은 Vero E6 세포 내 감염력에 비해 감소하였음을 확인하였다. 그러나 프로스페트힐 바이러스(PH)의 세포 내 감염력은 그다지 감소하지 않았다. Real-time RT-PCR의 결과, 평균적으로 병원성 한타바이러스의 세포 내 감염력이 각각 419 (nucleotide 1-419) AS construct에 의해 44.7%(HTN의 경우, 48%, SEO의 경우 35%, PUU의 경우 51%), 240 (nucleotide 180-419) AS construct에 의해 31.3% (HTN의 경우, 43%, SEO의 경우 27%, PUU의 경우 24%), β_(3) full AS construct에 의해 41.3% (HTN의 경우, 45%, SEO의 경우 30%, PUU의 경우 49%) 감소하였다. 또한, Western blot analysis의 결과, 평균적으로 병원성 한타바이러스의 세포 내 감염력이 각각 419 (nucleotide 1-419) AS construct에 의해 50.5%(HTN의 경우, 51.6%, SEO의 경우 48.4%, PUU의 경우 51.6%), 240 (nucleotide 180-419) AS construct에 의해 41.1%(HTN의 경우, 43.7%, SEO의 경우 36.1%, PUU의 경우 43.6%), β_(3) full AS construct에 의해 45.6% (HTN의 경우, 49.7%, SEO의 경우 37.8%, PUU의 경우 49.3%) 감소하였다. 위 세가지 β_(3) AS construct들을 이용하여 한타바이러스 감염력 저하를 유도하는 효과와 관련하여 real-time RT-PCR 및 Western blot analysis의 결과는 비슷한 양상을 보였다. 이러한 결과를 통해, β_(3) integrin의 N-terminal 영역에 속하는 β_(3) AS construct들 및 β_(3) full AS construct를 사용함으로써 바이러스 감염력을 저해할 수 있음을 확인하였다. 또한 전적으로 이 영역들만을 이용하는 것은 아니지만, 이러한 β_(3) integrin의 영역을 통해 한타바이러스는 β_(3) integrin과 상호작용하며, 세포 내로 침입할 수 있음을 확인하였다. 반면, 위의 β_(3) AS construct들에 비해 130 (nucleotide 1-130) AS 및 β_(3) integrin의 C-terminal 영역에 가까운 426 (nucleotide 1068-1493) AS construct들은 바이러스 감염력을 감소시키지 못하는 것으로 보아, 세포 내 침입 시 상호작용에 큰 영향을 미치지 못하는 것으로 확인되었다. 비병원성인 PH 바이러스의 경우, 모든 β_(3) AS construct들에 의해서 감염력이 거의 저해되지 못하였다(평균적으로, real-time PCR을 사용한 경우, 426 AS에 의해 26%인 것을 제외하고는 0 내지 8%정도 감소, Western blot analysis를 사용한 경우 426 AS에 의해 22.3%인 것을 제외하고는 6.3 내지 11.9%감소).


    It has been reported that hantavirus interacts with β_(3) integrin for the cellular entry in its infectious cycle. I also confirmed that α_(v)β_(3) and α_(Ⅱb)β_(3) integrins have a specific interaction with hantavirus by indirect immunofluorescent-antibody (IFA) test. In an attempt to identify the specific regions of β_(3) integrin required for the entry of hantaviruses into cells, four sense (S) and four antisense (AS) constructs from distinct regions of the β_(3) cDNA were generated by PCR and transfected into CHO or Vero E6 cells, respectively. Viral infectivity was determined by real-time RT-PCR assay for the quantification of vRNA. The expression of viral protein on virus-infected cells was detected by Western blot analysis. The suppression of α_(v)β_(3) or α_(Ⅱb)β_(3) expression by three of the β_(3) AS constructs reduced infectivity of pathogenic viruses, Hantaan (HTN), Seoul (SEO) and Puumala (PUU), but not Prospect Hill (PH) in Vero E6 cells. On an average in real-time RT-PCR assay, the infectivity was inhibited by 419 (nucleotide 1-419) AS at 44.7% level (at 48% level in HTN; at 35% in SEO; at 51% in PUU) and by 240 (nucleotide 180-419) AS at 34.7% level (at 43% in HTN; at 27% in SEO; at 34% in PUU) and β_(3) full AS at 41.3% level (at 45% in HTN; at 30% in SEO; at 49% in PUU). Averagely, in Western blot analysis, the infectivity was decreased by 419 (nucleotide 1-419) AS at 50.5% level (at 51.6% in HTN; at 48.4% in SEO; at 51.6% in PUU) and by 240 (nucleotide 180-419) AS at 41.1% level (at 43.7% in HTN; at 36.1% in SEO; at 43.6% in PUU) and β_(3) full AS at 45.6% level (at 49.7% in HTN; at 37.8% in SEO; at 49.3% in PUU). In regard of the effect of these constructs, the ratio of inhibition for the virus infections in the two assays (real-time RT-PCR and Western blot analysis) was shown a similar aspect of the results. This results suggest that the 419 (nucleotide 1-419) AS and 240 (nucleotide 180-419) AS belonging to N-terminal region on β_(3) integrin, as well as the β_(3) full AS inhibit the viral infectivity, and these regions mediate the β_(3) integrin-hantavirus interaction for viral entry into cell. The 130 (nucleotide 1-130) AS, and as well 426 (nucleotide 1068-1493) AS near the C-terminal region of β_(3) integrin did not particularly affect to the interaction, since both regions did not reduce the viral infectivity. For the nonpathogenic PH virus, almost no the β_(3) AS constructs influence on its infectivity (averagely, at 0 to 8%, except 26% by 426 AS by real-time PCR; at 6.3 to 11.9%, except 22.3% by 426 AS by Western blot analysis). The results indicated that the inhibitory activity of β_(3) AS constructs that target the N-terminal region of β_(3) integrin, as well as β_(3) full AS construct suggests a specific β_(3) integrin-hantavirus interaction. The peptides derived from the N-terminal region of β_(3) integrin might be potently related with hantavirus entry into cells.


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