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신규 히스톤 디아세틸레이즈 활성 조절물질 개발 및 작용기전 연구 원문보기
Development of new histone deacetylase inhibitors and their mode of actions

  • 초록

    히스톤 디아세틸레이즈 (HDAC)는 chromatin remodeling을 통한 유전자발현 조절에 중요한 효소 중 하나이다. 특정 조건하에서 고 발현된 HDAC은 하위의 유전자들의 발현을 변화시킴으로써 암을 포함한 다양한 병리현상을 나타내는 원인이 된다. 이러한 이유로 HDAC의 생리활성을 조절하는 것은 암 치료의 중요한 목표로 인식되어 왔다. 이전의 연구결과들에 따라 본 논문에서는 화학유전체학에 근거한 HDAC의 생리활성을 연구하기 위해 여러 타입의 HDAC 저해제를 개발하였고, 이들 저해제 및 형질전환 마우스를 이용하여 HDAC의 새로운 생물학적 기능을 밝혔다. 본 논문의 첫 연구에서 컴퓨터상의 예측프로그램과 화학합성을 이용하여 알려진 HDAC 저해제인 SAHA의 구조를 기본으로 새로운 HDAC 저해제를 개발하였고, 그들의 생리활성을 in vitro와 in vivo상에서 확인하였다. 새롭게 합성된 저해제 중 하나인 2d는 동물실험에서 SAHA보다 높은 항암활성을 나타냈다. 본 연구는 in vivo에서 높은 생리활성은 나타내는 약물의 개발 전략에 도움을 줄 수 있고, 새로 합성된 2d는 새로운 항암제로서 개발될 수 있을 것으로 기대된다. 두 번째 연구에서 mycophenolic acid (MPA)를 화학적으로 변형시켜 HDAC 활성을 저해하는 여러 유도체를 합성하였고, 그들의 생리활성을 확인하였다. 여러 유도체중 MPHA, 7-oAcMPHA, 7-OL MPHA가 가장 강한 저해활성을 나타냈고, 이들은 세포 내 아세틸 tubulin의 양을 증가시켰고, 이러한 생리활성을 전사단계 (RT-PCR, reporter gene assay, cDNA microarray 분석) 및 세포 수준 (migration assay, invasion assay) 에서 확인하였다. 본 실험을 통해 새로운 HDAC6 특이적인 저해제를 개발하였고, 이는 HDAC6의 생물학적 기능을 밝히는 연구 및 HDAC6관련 질병 치료에 도움을 줄 것으로 기대된다. 저해제 개발의 세번째 연구에서는 in vitro 상에서 HDAC활성을 저해하는 것으로 알려진 psammaplin (Psam)의 세포 내 활성 및 그들의 작용기전을 연구하였다. 여러 유도체중 Psam A가 가장 강한 저해활성을 나타내었고, 세포 내 아세틸 히스톤의 양을 증가시켜 HDAC target 유전자의 발현패턴에 영향을 주었다. Psam A는 환원제에 의해 monomeric 형태로 전환될 수 있고, 대표적 환원제인 glutathione의 생성을 억제한 세포에서는 Psam A의 저해활성이 감소하였는데, 이는 Psam A의 환원단계가 HDAC저해활성에 중요한 단계임을 알 수 있다. 이 실험을 통해 Psam A가 천연물유래의 prodrug으로 개발될 수 있을 것이라는 가능성을 제시하였다. 이제까지의 화학물질을 이용한 HDAC의 생리활성 연구에는 HDAC 효소활성을 직접적으로 저해하는 화학물질을 이용하였으나, HDAC 복합체의 구성을 저해하는 물질을 이용한 연구는 아직 이뤄지지 않았다. 두 번째 연구를 통해 우리는 yeast two hybrid system을 이용하여 HDAC 복합체의 구조를 파괴할 수 있는 물질을 찾아내었다. 이 물질은 특이적으로 HDAC과 MTA1의 상호작용을 억제함으로 전사수준과 세포수준에서 HDAC활성을 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 연구 결과는 HDAC 복합체의 세포 내 기능을 밝히는데 도움을 주며, HDAC 복합체를 억제하는 활성을 갖는 물질의 항암제로서의 개발 가능성을 제시하였다. PART Ⅱ에서는 HDAC의 새로운 생리활성을 연구하기 위해, 먼저 cDNA microarray 방법을 이용하여 HDAC 저해제를 처리한 세포의 유전자 발현 패턴 분석을 통해 새로운 HDAC의 target 유전자를 발굴하고자 하였다. 그 결과 calmegin이 새로운 HDAC의 target 유전자로서 발굴되었고, calmegin의 발현에는 HDAC과 CpG 메틸기 전이효소가 함께 관여한다는 사실과 HDAC이 calmegin의 promoter 부분 중 전사시작부분에 가까운 위치에 결합하고 있다는 것을 확인하였다. 본 연구결과를 근거로 HDAC이 calmegin의 전사를 조절함으로써 임신과정에 중요한 역할을 담당할 것이라 생각된다. 두 번째 연구에서는 HDAC 고발현 형질전환 마우스를 제작하여 in vivo 상에서 HDAC의 새로운 생물학적 기능을 제시하였다. DNA 및 전사 단계에서 형질전환을 확인하였고, HDAC의 고발현이 간 세포의 증식 및 간 조직의 지방간으로의 전환을 유도하였다. 이를 통해 지방간 발병에 HDAC이 중요한 인자임과 HDAC 저해제를 이용한 지방간 치료방법을 제시하였다. 마지막으로 천연물로부터 분리된 Apicularen A가 혈관내피세포의 증식을 효과적으로 억제한다는 것과 in vitro상에서 Apicularen A가 신생 혈관억제 효과를 가진다는 것을 밝혀냈다. 이는 이미 항암제로서의 개발 가능성을 가진 Apicularen A의 생리활성을 설명하는 기초를 마련했다. 결론적으로 위의 연구들은 화학유전체학을 토대로 한 HDAC의 생리활성 연구에 좋은 tool을 제공하며, 항암치료를 위한 새로운 약물의 개발에 적용될 수 있을 것으로 기대한다.


    Histone deacetylase (HDAC) is one of key enzymes for gene expression via chromatin remodeling. Up-regulation of HDAC under specific conditions causes several pathologies including carcinogenesis via repressing tumor suppressor genes and inducing tumor activating genes. Therefore, the regulation of HDAC activity has been recognized as a powerful strategy for cancer therapy. In the present studies, I exerted to discover several types of specific HDAC inhibitors to extensively utilize for chemical genetics-based study of the enzyme. In the first study, new catalytic inhibitors of HDAC based on the structure of SAHA, a well-known HDAC inhibitor, using in silico prediction program and isosteric replacement technique were synthesized. Compound 2d, one of newly synthesized compounds, potently inhibits HDAC activity both in vitro and vivo. Moreover, in animal model bearing human gastric tumor tissue, 2d showed more potent anti-tumor activity compared to SAHA. This study will help to establish a strategy for developing drugs with potent activity in vivo, and suggest that 2d can be developed as an anti-tumor agent. In the second study, I studied on the new biological activity of chemically modified mycophenolic acid (MPA), a well-known immunosuppressant. Among several derivatives, 7-OL, MPHA showed the most potent activity that inhibits enzymatic activity of HDAC and proliferation of HeLa cells, followed by 7-oAc MPHA and MPHA. I found that these compounds selectively induce hyper-acetylated tubulin in cells, indicating that they may selectively inhibit HDAC6 activity. The specific HDAC6 inhibitory activities of the compounds were confirmed in transcriptional (i. e., RT PCR, reporter gene assay, and cDNA microarray) and cellular level (i. e., migration assay and invasion assay). This study suggests that MPHA and its two related compounds may be a HDAC6-specific inhibitor and provides a useful tool for investigation of biological function of HDAC6. Next, I investigated the HDAC inhibitory activity of several psammaplin (Psam) derivatives and their mode of actions in cellular level. Among the derivatives of Psam, Psam A showed a potent inhibitory activity against HDAC in enzyme and anti-proliferation assay. Also, Psam A selectively induced hyperacetylation of histone H3, and altered the expression of HDAC target genes (i.e., gelsolin) in transcriptional level. We further found that Psam A can be reduced by reducing agent, and GSH-depleted cells were resistant to Psam A, implying that reduction step is essential for activation of Psam A after uptake into cells. Together, these data demonstrate that Psam A could be a new class of prodrug as HDAC inhibitor. Chemical genetics based study using catalytic inhibitors of HDAC has been progressing, but study with a chemical that regulates interaction between HDAC1 and other components, especially MTA1, in HDAC complex has not been reported yet. In the end of part Ⅰ, I discovered a new HDAC complex disruptor using yeast-two hybrid system previously established in our lab. The compound selectively disrupts the interaction of HDAC1 and MTA1 resulting in reduction of enzymatic activity of HDAC in mammalian cells. Consequently, other transcriptional (i.e., expression of HDAC target genes such as p21 and gelsolin) and cellular activities (i.e., angiogenesis) of HDAC complex were attenuated by the compound. This study suggests that the compound could be a powerful tool to investigate the role of HDAC1 complex in cell. In part Ⅱ, I investigated new biological function of HDAC via the disvovery of new target gene of HDAC using cDNA microarray analysis of transcriptional profile of HDAC inhibitor-treated cells. As the result, calmegin was selected as a novel target gene of HDAC from microarray data, and it was found that transcription of calmegin is regulated by HDAC and CpG methyltransferase in a coordinative way. Moreover, I found that HDAC binds to proximal region of calmegin promoter in chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay. These results suggest that HDAC is involved in fertilization via the transcriptional regulation of calmegin. In second study of part Ⅱ, human HDAC1 transgenic mice were established which harbored the human HDAC1 gene in the liver specific expressing vector. Overexpressed human HDAC1 was confirmed in DNA and RNA level, and expression of VEGF was significantly higher, whereas those of gelsolin and p21 were deacreased in the transgenic mice than those of the control. Moreover, the human HDAC1 expressing transgenic mice stimulated the proliferation of liver cells and interestingly exhibited a high incidence of hepatic steatosis and nuclear pleomorphism. These data demonstrate that HDAC1 plays a crucial role in steatosis, and suggest that inhibition of HDAC by specific inhibitor can be a new strategy for therapy of steatosis. Finally, I found that apicularen A (Api A) isolated from microbial cultural broth has anti-proliferative activity against BAECs, and antiangiogenic activity in in vitro angiogenesis assay, including invasion and tube formation assay at concentration of nanomolar range. This study provides an evidence to address, in part, the antitumor activity of Api A reported previously. In conclusion, the present studies provide new tools for chemical genomics-based study of HDAC. Moreover, the results from this study can be applied to new drug development for cancer therapy.


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