본문 바로가기
HOME> 논문 > 논문 검색상세

학위논문 상세정보

Activation-induced Cytidine Involved in Nuclear Reprogramming of Bovine Somatic Cells toward Pluripotency : 소 체세포 전능성을 위한 핵 초기화에 관여하는 AID 원문보기

  • 저자

    문송이

  • 학위수여기관

    경상대학교 대학원

  • 학위구분

    국내석사

  • 학과

    응용생명과학부 응용생명과학전공

  • 지도교수

    이병현

  • 발행년도

    2014

  • 총페이지

    ix, 50 p.

  • 키워드

    AID Nuclear reprotramming Pluripotency DNA demethylation;

  • 언어

    eng

  • 원문 URL

    http://www.riss.kr/link?id=T13534172&outLink=K  

  • 초록

    체세포 초기화는 많은 이점을 가지고 있다. 세포 초기화 과정에 많은 방법들이 이용될 수 있지만, 일반적으로 안정적인 재분화 상태를 도입하기에는 낮은 초기화 효율을 나타낸다. 분화된 포유류 체세포는 주요 전능성 관련 유전자 Oct-3/4와 Nanog를 포함하는 전능성 유전자들의 프로모터 영역이 주로 메틸화 되어있다. 이러한 메틸레이션은 전능성 유전자의 발현을 억제한다. 발표된 보고에 따르면, 면역계 단백질 Activation-induced cytidine deaminase (AID 또는 ACIDA)는 주요 전능성 유도 인자인 Oct-3/4와 Nanog의 도입에 요구되는 DNA 탈메틸화에 관여하여 초기화에 도움을 줄 수 있다고 알려져 있다. AID 단백질은 DNA 메틸기를 분해하여 포유류의 초기화에 관여한다고 추정되는 유일한 효소이다. AID 단백질은 DNA에서 메틸화된 사이티딘 (C) 염기를 티민 (T) 염기로 탈아미노화시키고 DNA 회복 시스템을 통해 메틸화된 사이티딘은 메틸기가 제거된 사이티딘으로 전변된다. DNA 탈메틸화 과정에 관여하는 AID의 역할을 확인하기 위해서, 완전히 분화된 소의 귀세포를 전분화 상태로 유도하는 초기화 실험을 수행하였다. 소의 림프절에서 RNA를 추출하였고 역전사 및 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 증폭시켰다. 증폭된 산물은 염기 분석을 통해서 미국 국립생물정보센터 (NCBI)에 등록된 소의 AID 유전자 서열과 일치함을 확인하였다 (인용번호 NM_001038682). 포유류 발현 벡터인 pCMV6-AC-IRES-GFP 벡터로 찾아낸 AID 유전자를 삽입하여 발현벡터를 구축하고 소의 체세포에 도입한 후 5~6일 가량 항생제 퓨로마이신을 이용하여 AID가 발현되는 세포를 선별하였다. 이후 줄기 세포 배양 조건에 맞추어 배양 및 관찰하였다. AID를 도입한 세포의 형태가 변하기 시작했고, 유전자 도입 19일 경, 넓고 긴 형태의 일반세포 및 벡터 도입 세포와는 다르게 세포 콜로니가 나타나기 시작했다. 벡터만 처리한 세포와 AID를 삽입한 세포 두 처리구 모두에서 초록 형광이 발현되는 것을 확인하였고 일반 세포에서는 확인되지 않았다. 또한 AID 도입한 세포는 알칼리성 인산가수 분해효소 염색에 반응하였고 전능성 유전자인 Oct-3/4, Nanog 그리고 Sox2의 발현을 확인할 수 있었지만 일반 세포와 벡터만 처리한 세포에서는 동일한 결과가 나타나지 않았다. 또한 도입한 ACIDA, 전능성 유전자 (Oct-3/4, Nanog 그리고 Sox2), 쥐나 인간의 배아 줄기세포 표면에 특이적인 항원성 물질로 전능성 표면 마커로 특징적인 (SSEA-4, Tra-1-60 그리고 Tra-1-81) 단백질들이 발현되었다. 실시간 중합효소 연쇄반응을 통해 AID를 도입한 세포에서 전능성 인자인 Oct-3/4와 Nanog의 발현이 일반 세포와 벡터와 비교했을 때 상당히 증가했음을 알 수 있었다 (p


    Reprogramming of somatic cell is likely to provide a variety of advantages for therapeutic areas. Although several strategies can be used to convert differentiated cells into pluripotent state, yet they are generally characterized by a low efficiency of reprogramming, reflecting the remarkable stability of the differentiated state (Vincent et al., 2011). In mammary, differentiated somatic cells are mostly methylated in the promoter regions of pluripotent genes (Oct-3/4 and Nanog), which make pluripotent genes repressed. An immune system protein called as activation-induced cytidine deaminase (AID; also known as ACIDA) is unexpectedly able to aid in reprogramming due to its involvement in DNA demethylation that is required for induction of the two key pluripotent genes (Oct-3/4 and Nanog) (Wenbin, 2010). AID is the only enzyme that has been suggested as the putative DNA demethylase protein in mammalian reprogramming (Popp et al., 2010). This enzyme can deaminate methylated cytidine bases into thymine bases in the DNA. Therefore, a methylated cytosine is able to be replaced to an unmethylated one by DNA repair pathway. In order to examine a role of AID involved in DNA demethylation, we performed to reprogram bovine ear cells which were totally differentiated cells into pluripotent state. Total RNAs were extracted from the bovine lymph nodes and then amplified by reverse transcription-PCR. These products were identified as sequences of bovine AID gene (accession No. NM001038682). By transfection of mammalian expression vector (pCMV6-AC-IRES-GFP) cloned with AID to bovine somatic cells, they were selected by using puromycin for 5-6 days. After then, they were maintained on culture condition for stem cells. As results, the morphology of AID transfected cells was dramatically changed into colonies on the day 19, whereas control and only vector transferred cells were shown as that of somatic cells. AID transfected cells were strongly stained by alkaline phosphatase regents, and three key pluripotent genes (Oct-3/4, Nanog and Sox2) were induced to express, but control and only vector treated cells were not expressed. In addition, the AID transfected cells were positively exhibited antibodies against ACIDA (AID) as well as Oct-3/4, Nanog and Sox2 which were pluripotent marker genes, and SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81 which have been widely used to characterize mouse and human embryonic stem cells as pluripotent surface markers. The expressions of Oct-3/4 and Nanog in the AID transfected cells were significantly increased when compared to the control and only vector treated cells by q-PCR (p


 활용도 분석

  • 상세보기

    amChart 영역
  • 원문보기

    amChart 영역