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Functional Analysis of Na+ and K+ Sensitive1 in Arabidopsis 원문보기

  • 저자

    김찬민

  • 학위수여기관

    경상대학교 대학원

  • 학위구분

    국내석사

  • 학과

    응용생명과학부 환경생명과학전공

  • 지도교수

  • 발행년도

    2014

  • 총페이지

    xi, 43 p.

  • 키워드

    NKS1 TPC1 TPK1;

  • 언어

    eng

  • 원문 URL

    http://www.riss.kr/link?id=T13534192&outLink=K  

  • 초록

    21세기에 들어 과도한 인구증가와 급변하는 산업화에 의해 지구촌은 사막화, 온난화, 오존층 파괴, 화석 연료의 고갈 등 지구 환경의 악화와 생태계의 불균형이 초래되었다. 복합적인 환경스트레스(가뭄, 저온, 고온, 고염 등)는 식물의 생장과 작물의 생산에 막대한 피해를 주며, 불안정한 식량공급 문제를 크게 악화시켰다. 지구상에 농경이 가능한 토지는 지구면적의 약 10% 정도에 불과하며, 그 중에서도 약 80%의 대부분 토지가 환경 스트레스 피해로 유실되고 있다. 환경 스트레스 피해가 심각한 토지 중 가장 심각한 문제가 지구 사막화 현상이다. 이러한 관점에서 농업식물 스트레스 연구는 현실로 다가온 환경문제와 미래 식량위기라는 급박한 상황을 극복하는 수단이다. 동물과 달리 식물은 이동할 수 없기 때문에 메마른 토양, 물 부족 등의 생육환경이 악화될 경우, 동물은 다른 곳을 찾아 떠나지만 식물은 일단 뿌리 내린 곳에 적응해야 한다. 따라서 식물은 건조, 추위 등 환경 스트레스를 견딜 수 있는 능력을 키웠왔으며, 변화된 외부환경에 적응하기 위하여 정교한 방어 시스템을 갖추고 있다. 본 연구실에서는 최근에 Sodium과 Potassium에 감수성을 보이는 돌연변이체를 분리하고 NKS1 (Na+-and K+-sensitive 1)이라 명명하였다. NKS1은 19kDa의 단백질로서 ER에 존재하였다. 본연구에서 NKS1의 환경스트레스방어작용에 관한 기능을 밝히기 위하여 분자세포생물학적인 방법을 사용하여 연구를 수행하였다. 우선 nks1 돌연변이체가 이온 스트레스 뿐만 아니라 다른 비생물학적 스트레스에 어떠한 영향을 받는지 확인하기 위하여, nks1 돌연변이체를 건조 스트레스에 노출시켜 nks1 돌연변이체의 표현형을 관찰하였다. 그 결과 nks1 돌연변이체는 건조 스트레스에 노출되게 되면 민감한 표현형을 나타내었다. nks1 돌연변이체에 NKS1 cDNA를 과다 발현시킨 형질전환체를 건조 스트레스에 노출시킨 결과, nks1 돌연변이체의 민감한 표현형이 사라지는 현상을 관찰 할 수 있었다. 또한 건조 스트레스에 따른 물의 손실량을 측정해 본 결과, 야생형의 식물체보다 nks1 돌연변이체에서 물의 손실이 더 빨리 진행되어졌다. 이와 같은 결과를 통하여 NKS1은 건조 스트레스에 밀접한 관련이 있다는 사실을 확인하였다. 다양한 스트레스 호르몬 중에서 ABA는 식물이 생산하는 물질로 건조 스트레스에서 식물의 생존을 돕는 주요 호르몬이다. ABA 호르몬은 식물의 잎에 있는 기공을 열고 닫는 역할을 한다. 건조한 날씨 탓에 식물 속 수분이 부족해지면 ABA 호르몬이 많이 합성돼 기공을 닫는다. 수분이 증발되지 않도록 돕는 것이다. 또한 기공에서 광합성이 수행되면 여러 유기산들이 합성되고, Ca2+의 농도가 증가하게 되며, 빛에 의해 활성화되는 H+-펌프에 의해 H+ 농도구배를 이루게 된다. 이를 주요 원동력으로 사용하여 K+과 같은 이온이 유입된다. 결과적으로 기공 내의 삼투압이 커지게 되며 주변의 물이 기공 내로 유입되어 기공 내의 팽압이 증가한다. ABA 및 Ca2+는 식물이 건조 스트레스에 노출되었을 경우 식물 생존에 매우 중요하기 때문에, 본 연구원은 ABA 및 Ca2+에 의존적인 경로를 보다 자세히 연구하고자 하였다. 건조 스트레스에 의해 nks1 돌연변이체의 기공이 영향을 받는지 조사하기 위하여, 야생형과 nks1 돌연변이체를 건조 스트레스에 노출시킨 후, 기공 개폐를 관찰하였다. 그 결과 nks1 돌연변이체의 기공은 건조 스트레스에 노출되었음에도 불구하고 기공이 닫히지 않는 것을 확인하였다. 또한 야생형과 nks1 돌연변이체를 exogenous ABA에 노출시켰을 때, nks1 돌연변이체의 기공은 야생형의 기공에 비하여 닫히지 않는 현상을 보였다. 이러한 결과는 NKS1이 직접적으로 기공의 개폐 조절에 관여한다는 사실을 시사하는 것이다. 식물이 건조 스트레스에 노출하게 되면 세포내의 Ca2+ 농도가 증가하게 되는데, NKS1이 세포내의 Ca2+ 농도 조절에 관여하는지 관찰해 보기로 하였다. CaCl2가 함유된 배지에서 nks1 돌연변이체의 생장을 관찰하였다. 그 결과 nks1 돌연변이체의 뿌리 생장은 CaCl2가 함유된 배지에서 nks1 돌연변이체의 뿌리 생장이 저해 받았다. 또한 식물체 내의 Ca2+ 농도를 측정하기 위하여, 야생형과 nks1 돌연변이체에 CaCl2를 처리하여 식물체 내의 Ca2+ 농도를 측정하였다. CaCl2를 처리한 nks1 돌연변이체의 shoot 부분에서 Ca2+ 농도가 야생형에 비해 더 많이 축적되어졌다. 이러한 결과는 NKS1이 세포내의 Ca2+ 신호전달 및 항상성에 관여한다는 사실을 보여주는 것이다. 식물 내에서 양이온 channel들은 기공 개폐를 조절하는데 중요한 역할을 한다. 이러한 양이온 channel들에는 Shaker 그룹, KCNK 그룹, Kir 그룹, TPC1 (two-pore channel 1) 그룹, CNGC (cyclic nucleotide gated channel) 그룹, 그리고 GLR (glutamate receptor) 그룹 등 6 가지 그룹이 포함되어 있다. NKS1과 각각의 양이온 channel들 사이의 interaction을 확인해 보기 위하여 Luciferase complementation imaging (LCI) 분석을 수행하였다. 그 결과 NKS1은 TPC1 그룹의 TPC1, KCNK 그룹의 TPK1과 interaction을 하는 반면, Shaker 그룹의 AKT2, Kir 그룹의 KCO3, CNGC 그룹의 CNGC2, GLR 그룹의 GLR3.5 channel과는 interaction을 하지 않았다. 이러한 결과는 BiFC 분석 방법을 통하여 재확인하였다. NKS1과 복합체를 형성하고 있는 TPK1과 TPC1은 vacuolar membrane에 존재하면서 세포내의 K+ 또는 Ca2+ 이온의 항상성을 조절하는 channel들이다. 식물 내에서의 Ca2+의 항상성 조절 기작 연구는 동물에서의 조절 기작 연구보다 아직 미흡한 상태이다. 그리하여 동물 시스템에서 잘 알려진 Ca2+ 조절 기작을 식물에 적용하고자 하였다. 동물내의 Ca2+ 항상성 조절기작에는 여러 핵심 단백질들이 존재한다. 그 중에 STIM1은 multimer 형태로 존재하면서 Ca2+ channel인 ORAI1 단백질의 활성을 직접적으로 조절하여 세포내의 Ca2+ 항상성을 유지한다. NKS1이 STIM1과 같이 multimer를 형성하는지 관찰하기 위하여, 우선 NKS1이 homo-dimer를 이루는지 관찰하였다. BiFC 분석방법을 통하여 NKS1이 homo-dimer를 형성한다는 사실을 확인 하였다. 이러한 사실은 STIM1 단백질처럼, Ca2+ 조절 기작에서 NKS1이 multimer를 형성하여 Ca2+ channel인 TPC1 또는 K+ channel인 TPK1을 조절하면서 기공 내의 Ca2+ 농도를 조절하는 기능을 할 가능성을 시사하고 있다. 본 연구에서는 이러한 NKS1의 분자생화학적인 기능연구를 통하여 NKS1이 식물 건조스트레스 적응기작에 중요한 역활을 하고 있음을 규명하였다. 이러한 연구는 아직까지 많은 연구가 필요한 건조스트레스에 대한 식물기공개페 조절 기작을 이해할수 있는 중요한 단서로 활용될수 있으며 궁극적으로는 건조스트레스에 견딜수 있는 작물을 개발하는 중용한 기초자료로서 활용될것으로 기대되어진다.


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