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Functional Characterization of Arabidopsis HOS15, a WD40-repeat Protein, in Stress Responses 원문보기

  • 저자

    신명철

  • 학위수여기관

    경상대학교 대학원

  • 학위구분

    국내박사

  • 학과

    응용생명과학부 환경생명과학과

  • 지도교수

  • 발행년도

    2014

  • 총페이지

    xi, 91p.

  • 키워드

    HOS15 NCoR1 HDA9 Cold CUL4 DDB1 GI salt;

  • 언어

    eng

  • 원문 URL

    http://www.riss.kr/link?id=T13534193&outLink=K  

  • 초록

    환경스트레스는 현대 농업에 있어서 작물의 생산량에 영향을 주는 주요한 요소이다. 식물은 동물과는 달리 고착생물체로서 냉해, 고염과 같은 외부의 다양한 환경스트레스에 노출이 되면 피할 수 없다. 그러나 식물은 이러한 외부의 열약한 환경에서 생존하기 위하여 환경변화를 감지하며 정교한 신호전달체계를 활성화하여 외부변화에 적응하고 있다. 하지만 식물이 어떻게 외부환경변화를 감지하고 방어하는지에 대한 구체적인 신호전달 기작 및 이에 대한 분자세포생물학적인 연구는 아직 구체적으로 밝혀져 있지는 않다. 선행연구에서 luciferase image screening법을 통하여 분리된 HOS15은 저온신호전달에서 핵심적인 역할을 수행하는 것으로 밝혀졌으며, 아미노산구조분석결과 HOS15은 LisH motif와 8개의 WD40-repeat를 코딩 함으로써 동물에서 chromatin remodeling을 조절하는 co-repressor complex의 구성인자로 알려진 transducin β-like 1 (TBL1)과 유사함을 알 수 있었다. 또한 HOS15 단백질은 핵에 존재하며 histone과 직접결합하고 deacetylating시킴으로서 repressor로서 기능하는 것으로 밝혀졌다. 그러나 단백질의 구체적인 작용 기작에 대하여서는 명확히 밝혀 지지는 않았다. 따라서 본 연구에서는 애기장대에서 유전학적 생화학적 세포생물학적인 연구방법을 이용하여 환경스트레스에 노출이 되였을 때 기능하는 HOS15 단백질의 구체적인 작용기작에 관한 연구를 수행하고자 하였다. 동물에서 TBL1은 histone deacetylase와 NCoR/SMRT와 함께 complex를 이루어 (NCOR/SMRT-HDAC3-TBL1) 기능한다고 알려져 있다. 따라서 동물모델과 마찬가지로 TBL1과 유사한 구조를 가지로 있는 HOS15이 식물에서도 이들과 유사한 단백질과 complex를 이루어 저온 스트레스 신호전달에 기능하는지를 밝히고자 하였다. 이를 위하여 애기장대에서 동물의 NCoR과 유사한 구조를 가지는 단백질을 찾아 내고 이를 AtNCoR1이라고 명명하였다. 또한 동물의 HDAC3와 가장 가까운 애기장대의 HDAC가 AtHDA9이라는 것을 알 수가 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 yeast two hybrid법, 담배식물체를 이용한 luciferase complementation imaging 법 및 pull down을 통하여 조사해본 결과 HOS15이 애기장대의 AtNCoR1과 histone deacetylase 인 HDA9가 결합하여 HOS15-AtNCoR1-HDA9 복합체를 형성함을 알 수 가 있었다. 또한 hos15-2, ncor1과 hda9의 돌연변이 식물은 저온 스트레스에 대한 저항성이 현저히 낮다는 것을 알게 되어 HOS15-AtNCoR1-HDA9 복합체는 저온 스트레스에 반응함에 있어서 positive한 역할을 하는 조절 인자라는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 HOS15는 저온스트레스에서 중요한 작용을 하는 전사 인자인 세 개의 CBF 단백질 가운데서 특이하게 저온 스트레스에 negative 역할을 하는 CBF2와 더욱 강하게 결합한다는 것을 알게 되었으며 CBF 단백질의 표적 유전자인 RD29A와 COR15A 발현양은 hos15-2, ncor1과 hda9 돌연변이체 식물에서 모두 낮다는 것을 확인 하였고 HOS15는 또한 RD29A와 COR15A유전자의 promoter에도 직접 작용한다는 것을 chromatin immunoprecipitation (ChIP)법을 이용하여 확인하였다. 이러한 연구 결과는 HOS15이 CBF2를 negative하게 조절을 하여 CBF의 표적 유전자인 RD29A와 COR15A 유전자의 발현을 유도함으로써 저온 스트레스에 저항한다는 사실을 시사하는 것이다. CUL4-based E3 ligases는 표적 단백질의 ubiquitination과 분해에 관여하는 E3 ubiquitin ligases의 한 종류이다. CUL4-based E3 ligases는 RBX1-CUL4-DDB1이 주요한 구성요소로 알려져 있다. 최근의 보고에 의하면 WD40-repeat 단백질 중에서 16개의 아미노산으로 구성된 DDB1 binding WD40 (DWD) motif를 가지고 있는 WD40-repeat 단백질은 adaptor로 작용하는 DDB1과 직접 결합하여 CUL4-based E3 ligases의 substrate receptor로서 작용한다. 본 연구에서는 아미노산 구조분석 결과 HOS15이 DWD motif를 가지고 있다는 것을 알게 되어, HOS15이 CUL4-based E3 ligases의 substrate receptor 일 가능성을 유추 할 수 있었다. 이러한 가능성을 확인하기 위하여 yeast two hybrid법, 담배와 애기장대에서 pull down법을 이용하여 조사한 결과 HOS15이 DDB1, CUL4와 모두 결합한다는 사실을 알았다. 최근 보고에 의하면 cul4 돌연변이 식물은 고염에 낮은 저항성을 보여 주어 고염 스트레스에서 CUL4가 positive한 역할을 한다고 알려져 있다. 이와 같은 사실은 CUL4-based E3 ligases의 substrate receptor인 HOS15가 고염스트레스 신호전달에 기능할 가능성을 시사하는 것이다. 따라서 본 연구에서는 우선 hos15-2 돌연변이 식물체를 NaCl이 첨가된 배지에 키운 다음 염 반응에 대하여 조사 하였다. 그 결과 hos15-2 돌연변이체는 씨앗의 발아와 뿌리의 성장에서 모두 낮은 저항성을 나타낸다는 것을 알게 되어 HOS15이 염 반응에 있어서 positive한 역할을 한다는 것을 알 수가 있었다. 또한 이러한 사실은 E3 ligases의 substrate receptor인 HOS15이 고염스트레스에 negative하게 작용하는 인자를 분해할 가능성을 시사하는 것이다. 따라서 본 연구는 최근 본 연구실에서 보고한 고염스트레스 신호전달에 있어서 negative한 조절인자로 알려져 있는 GI (GIGANTEA)가 HOS15의 substrate일 가능성을 조사하고자 하였다. 그 결과 GI 단백질은 HOS15과 CUL4 모두에 결합한다는 것을 담배와 애기장대에서 pull down법으로 확인하였다. 또한 35S::GI-HA/hos15-2 식물체에서 GI-HA의 단백질 양이 35S::GI-HA비하여 높다는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 GI가 CUL4-based E3 ligases인 HOS15의 표적 단백질로서 GI 단백질의 분해가 HOS15의 영향을 받는다는 것을 의미하며, 고염스트레스에서 hos15-2 돌연변이체가 씨앗의 발아와 뿌리의 성장에서 모두 낮은 저항성을 나타내는 것은 hos15-2 돌연변이체에서 증가된 GI 단백질의 양과 일정한 관계가 있다는 것을 나타내는 것이다. 이상의 결과를 바탕으로 HOS15은 저온스트레스와 고염스트레스 적응과정에 있어서 핵심적인 역할을 수행하는 중요한 단백질임을 알 수 있었으며, 이러한 연구를 통하여 얻은 기초지식은 식물의 환경스트레스 적응기작 연구 및 저항성 식물체 개발을 위한 기초 자료로 이용될 것이다.


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