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Application of Proteomics Method for Identification and Characterization of Extracellular Vesicles using Mass Spectrometry 원문보기

  • 저자

    Do-young Choi

  • 학위수여기관

    경희대학교

  • 학위구분

    국내박사

  • 학과

    화학과

  • 지도교수

    김광표

  • 발행년도

    2014

  • 총페이지

  • 키워드

    Extracellular vesicles Proteomics mass spectrometry Multi-Omics;

  • 언어

    eng

  • 원문 URL

    http://www.riss.kr/link?id=T13536595&outLink=K  

  • 초록

    PARTⅠ. 중간엽줄기세포 에서 유래한 세포 밖 소포체의 단백체 분석 중간엽줄기세포는(MSCs) 퇴행성 또는 불치의 질병 치료를 위한 유망한 수단으로 등장했다. 최근에 MSCs 에서 유래한 세포 밖 소포체가 동물모델에서 조직손상 회복에 관여한다고 연구가 진행되었다. 그래서, 우리는 그들의 치료효과를 조사하기 위해 MSCs 에서 유래한 세포 밖 소포체의 단백체 프로파일링을 시도하였다. LC − MS/MS 분석을 통하여 총 730 개의 단백체를 동정하였다. 동정된 단백질들 중 에는 5개 의 확인 마커와 2개의 가변적인 마커가 포함되어있고 43개의 표면 수용체 와 MSCs 의 자가재생과 분화에 관련된 신호전달 인자가 포함되어 있다. 시스템 바이올로지를 이용한 기능분석을 통하여 이러한 세포 밖 소포체 단백질들이 세포의 증식, 부착, 이동과 형태형성에 관여한다는 것을 확인하였다. MSCs 의 세포 밖 물질에서 자가재생과 분화에 관련된 유전자와 단백질을 통합해 보면, 치료효과를 낼 수 있는 후보들이 잠재적인 물질들이 존재한다. (1) 표면 수용체 (PDGFRB, EGFR, and PLAUR); (2) 신호전달 인자 (RRAS/NRAS, MAPK1, GNA13/GNG12, CDC42, and VAV2); (3) 세포부착 (FN1, EZR, IQGAP1, CD47, integrins, and LGALS1/LGALS3); (4) MSCs 관련 항원 (CD9, CD63, CD81, CD109, CD151, CD248, and CD276). 따라서, MSCs 에서 유래한 세포 밖 소포체의 단백체 프로파일은 조직의 복구 및 재생의 잠재력을 이해하기 위한 포괄적인 기초 정보를 제공한다. PARTⅡ.폐암 환자의 흉수에서 유래한 세포 밖 소포체 단백체의 동정 및 특징 분석 세포 밖 소포체는 폐암, 대장암, 전립선 암 등 다양한 암과 관련이 있다. 세포 밖 소포체는 종양세포 등에서 흉수로 방출된다. 최근에 연구를 통하여 이러한 흉수 안에 세포 밖 소포체의 종양 발전 잠재적 병의 발전 등 다양한 역할에 관여한다고 밝혀졌지만 아직 정확한 단백체 구성에 대한 정보는 알려져 있지 않다. 이번 연구에서 우리는 폐암 환자의 흉수에서 고순도로 분리한 세포 밖 소포체의 단백체를 분석하였다. LC-MS/MS 분석을 통하여 총 912 개의 세포 밖 소포체 단백질을 동정하였다. 3명의 환자시료를 3반복 실험을 통하여 다른 질병에서 발견되지 않은 특이적인 단백질을 발굴하였다. 바이오정보 분석을 통하여 병인과 관련된 단백질들 특히 상피세포성장인자 와 관련된 단백질 들이 동정되었고, 동정된 단백질 들은 폐암의 잠재적인 마커가 될 것으로 기대된다. 이러한 연구는 세포 밖 소포체의 암에 관한 다양한 기능을 연구하는데 도움을 줄 것이며, 효과적이고 빠른 폐암 진단의 발전을 가지고 올 것으로 기대된다. PARTⅢ. 약재내성 폐암세포의 세포 밖 소포체는 종양 미세형성 조절 Gefitinib 등의 상피세포성장인자-타이로신 활성인자 억제제(TKIs) 상피세포 성장인자에 돌연변이를 가지고 있는 비소세포폐암 환자에게 투여하기 적합한 약 이지만 약을 투여한 환자에서 약재내성이 발생한다. 이 연구의 주된 목적은 약재내성을 획득한 비소세포 폐암의 세포 밖 소포체의 단백체를 분석해 중요한 단백질 분자를 발굴하는 것이다. LC-MS/MS 분석을 통하여 내성세포에서 과 발현 된 신뢰도 높은 644개의 세포 밖 소포체 단백질을 동정하였다. 추가 분석을 통하여 몇 개의 신호전달 인자 기전에 관련되어 있는 구성성분을 발견하였고 특히 내성세포의 세포 밖 소포체 에서 AKT/mTOR 신호전달 기전 관련 단백질들이 과 발현 된다는 결과를 확인 하였다. 약재내성을 가지지 않는 세포에 내성을 가진 세포 밖 소포체를 투여하였을 때 세포 밖 소포체는 AKT/mTOR 신호전달 기전을 이용하여 분화, 약재내성획득 등의 현상이 증가되었다. 이러한 연구는 세포 밖 소포체 단백질에 대한 새로운 시각을 보여주며 질병의 진단과 내성의 예측에 중요한 전략으로 사용될 수 있다.


    PARTⅠ. Proteomic Analysis of Extracellular Vesicles Derived from Human Mesenchymal Stem Cells Mesenchymal stem cells (MSCs) have emerged as a promising means for treating degenerative or incurable diseases. Recent studies have shown that extracellular vesicles (EVs) from MSCs (MSC-EVs) contribute to recovery of damaged tissues in animal disease models. Here, we profiled the MSC-EV proteome to investigate their therapeutic effects. LC − MS/MS analysis of MSC-EVs identified 730 EV proteins. The MSC-EV proteome included five positive and two variable known markers of MSCs, but no negative marker, as well as 43 surface receptors and signaling molecules controlling self-renewal and differentiation of MSCs. Functional enrichment analysis showed that cellular processes represented by the MSC-EV proteins include cell proliferation, adhesion, migration, and morphogenesis. Integration of MSC's self-renewal and differentiation-related genes and the proteome of MSC-conditioned media (MSC-CM) with the MSC-EV proteome revealed potential EV protein candidates that can be associated with the therapeutic effects of MSC-EVs: (1) surface receptors (PDGFRB, EGFR, and PLAUR); (2) signaling molecules (RRAS/NRAS, MAPK1, GNA13/GNG12, CDC42, and VAV2); (3) cell adhesion (FN1, EZR, IQGAP1, CD47, integrins, and LGALS1/LGALS3); and (4) MSC-associated antigens (CD9, CD63, CD81, CD109, CD151, CD248, and CD276). Therefore, the MSC-EV proteome provides a comprehensive basis for understanding the potential of MSC-EVs to affect tissue repair and regeneration. PARTⅡ. Identification and characterization of proteins isolated from Extracellular vesicles derived from human lung cancer pleural effusions Extracellular vesicles (EVs, also known as exosomes, ectosomes, microparticles) are released by various cancer cells, including lung, colorectal, and prostate carcinoma cells. EVs released from tumor cells and other sources accumulate in the circulation and in pleural effusion. Although recent studies have shown that EVs play multiple roles in tumor progression, the potential pathological roles of EV in pleural effusion, and their protein composition, are still unknown. In this study, we report the first global proteomic analysis of highly purified EVs derived from human nonsmall cell lung cancer (NSCLC) pleural effusion. Using nano-LC–MS/MS following 1D SDS-PAGE separation, we identified a total of 912 EV proteins with high confidence. Three independent experiments on three patients showed that EV proteins from PE were distinct from EV obtained from other malignancies. Bioinformatics analyses of the MS data identified pathologically relevant proteins and potential diagnostic makers for NSCLC, including lung-enriched surface antigens and proteins related to epidermal growth factor receptor signaling. These findings provide new insight into the diverse functions of EVs in cancer progression and will aid in the development of novel diagnostic tools for NSCLC PARTⅢ. Extracellular Vesicles of Gefitinib-Resistant Non-Small Cell Lung Cancer Regulate the Tumor Microenvironment EGFR-tyrosine kinase inhibitors (TKIs), including gefitinib, are the first-line treatment of choice for NSCLC patients who harbor activating EGFR mutations, however, acquired resistance to EGFR-TKIs is inevitable. The main objective of this study was to identify informative protein signatures of tumor extracellular vesicles (EV) derived from gefitinib-resistant NSCLC cells using proteomics analysis. Nano-LC–MS/MS analysis identified with high confidence (FDR


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