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Characterization of the Molecular Actions and Efficacy of Ginsenosides on Bone with Emphasis on Osteoporosis 원문보기

  • 저자

    Muhammad Hanif Siddiqi

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    평균 수명의 증가와 함께 골다공증 등 대사성 골질환의 유병률은 전세계적으로 증가하고 있다. 골다공증은 골 양의 감소와 골조직의 미세 구조의 결함 (microarchitectural deterioration) 으로 뼈의 약화와 골절에 대한 감수성이 증가된 전신적인 골격계의 질환이다. 골다공증은 주로 조골세포 (뼈형성 세포)와 파골 세포 (골 흡수 세포)와 같은 두 개의 다른 세포에 의해 제어된다. 이러한 세포의 활동의 모든 중단되면 골다공증에 이르게 한다. 지금까지 골다공증에 대한 합성 의약품의 작용은 여러 가지 부작용과 연관되어 있기 때문에, 골다공증의 치료를 위한 천연 화합물로써 해결책을 찾을 필요가 있다. 인삼은 특히 한국, 일본, 중국에서 여러 질병의 치료를 위한 명약 중 하나로써 인삼의 주요 약리성분인 진세노사이드는 protopanaxadiol (PPD)과 protopanaxatriol (PPT)로 나뉘게 된다. 두 그룹은 항암, 면역기능 강화 및 원기회복 등 다양한 약리활성을 지니고 있으며, 이러한 진세노사이드는 조골세포의 분화와 골조직을 개선 또는 파골세포 특정 마커를 억제하거나 골다공증에 대해 보호 역할을 하고 있다. 이 논문은, In silico 와을 통하여, 마우스의 조골세포인 MC3T3-E1, MG-63 ,대식세포 RAW 264.7을 이용하여, 진세노사이드 Rg5:Rk1, Rh1, F1 그리고 Rg3의 항 골다공증 효과에 대해 알아보았다. 진세노사이드 Rg5:Rk1, Rh1, F1그리고 Rg3의 조골화과정(osteoblastogenesis) 및 파골화과정(osteoclastogenesis) 효과에 대한 실험에 앞서 MC3T3-E1, MG-63와 RAW 264.7 세포를 이용하여 MTT 분석을 이용하여 세포독성을 확인 하였다. 그 결과 Rg5:Rk1 은 1-50 ㎍/㎖, Rh1은 1-300 μM, F1은 1-200 μM, Rg3에서는 1-10 μM 농도에서 생존의 유의한 감소를 보여 주었다. 이러한 세포독성의 차이는 진세노사이드의 화학 구조의 차이로 보여진다. 또한, Rg5:Rk1, Rh1, F1을 이용하여 조골화 효과에 대해 알아보고자 BMP-2/RUNX2/ p38MAPK 신호전달체계를 이용하여 alkaline phosphatase (ALP), type I collagen (Coll-I), mineralization and Alizarin red S (ARS) 와 RT-PCR, Western Blot을 해본 결과, 농도의존적으로 감소함을 알 수 있었다. 진세노사이드 Rg3는 분자 도킹과 RANKL로 유도된 RAW264.7 세포로 세포독성확인과, RANKL, p38, JNK/ERK 신호전달체계를 통하여, tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP), pit formation 에세이, osteoclast multi nuclei TRAP staining 분석을 한 결과, 진세노사이드 Rg3가 파골형성 억제에 상당한 효과가 있음을 알 수 있었다. 결론적으로, 본 연구에서 제시한 결과는 진세노사이드 Rg5:Rk1, Rh1, F1 그리고 Rg3가 골 형성과 파골세포의 활성화에 관여하는 신호전달 단백질의 활성 억제에 대해 상당한 효과가 있다고 사료된다.

    With the increase of life expectancy, the prevalence of metabolic bone diseases including osteoporosis is also increasing throughout the world. The osteoporotic bone characterized by the microarchitectural deterioration resulting porous and fracture bone is posing a major burden on affected individuals as well as on society. The osteoporosis is mainly controlled by two distinct cells such as osteoblast (bone forming cells) and osteoclast (bone resorption cells). Any disruption in the activity of these cells leads to osteoporosis. So far several therapeutic agents have been studied for osteoporosis management, but mostly associated with several side effects. Therefore, it is necessary to find alternative therapeutic remedy such as natural compound for the treatment of osteoporosis. Among the natural compounds Panax ginseng Meyer (Araliaceae), hereafter refer as P. ginseng is one of the most promising medicinal herb prescribed for the treatment of different diseases throughout the world especially in Korea, Japan and China. Ginsenosides are the most important naturally occurring constituents particularly found in P. ginseng. On the bases of structure they are grouped as protopanaxadiol (PPD) and protopanaxatriol (PPT). Both group have diverse pharmacological activities such as anti-cancer, anti-inflammation and anti-tumor. Evidence in in vitro and in vivo based experimental systems suggests these ginsenosides may play a vital and protective role in osteoporosis either improving osteoblast differentiation and mineralization or inhibiting the osteoclastogenesis specific marker. This study was conducted to develop in silico and in vitro screening to elucidate the osteoprotective role of different PPD and PPT types ginsenosides such as Rg5:Rk1, Rh1, F1 and Rg3 from P. ginseng in osteoporosis using mouse osteoblastic MC3T3-E1, human MG-63 cells and RAW 264.7 macrophages cells as in vitro model, and hence to provide the scientific approach at the characterization and identification of their cellular and molecular level action for the development of anti-osteoporotic drugs. To examine the anabolic efficacy of the above mentioned ginsenosides on osteoblastogenesis and osteoclastogenesis, MC3T3-E1, MG-63 and RAW 264.7 cells were treated with different concentration of Rg5:Rk1, Rh1, F1 and Rg3. First, cytotoxicity potential of the tested compounds were determined. Cell viability was confirmed using the MTT assay. Analysis of our results showed no significant loss of viability at 1-50 µg/ml concentration of Rg5:Rk1, 1-300 µM of Rh1, 1-200 µM of F1, and 1-10 µM of Rg3. There difference in cytotoxic properties, is because of the differences between the chemical structure of the tested ginsenosides. Further, the stimulative effects of three compounds such as Rg5:Rk1, Rh1 and F1 for the differentiation and mineralization (osteoblastogenesis) were evaluated by assessing alkaline phosphatase (ALP), type I collagen (Coll-I) contents, mineralization and Alizarin red S (ARS) staining activity through BMP-2/RUNX2/ p38MAPK pathways. Moreover, analysis of our RT-PCR and Western Bolt study indicated that these compounds (Rg5:Rk1, Rh1, and F1) doses dependently elevating the osteoblast differentiation and mineralization. Additionally the inhibitory effects of ginsenoside Rg3 were evaluated by using both molecular docking study followed by in vitro study validation using RAW 264.7 cells stimulated with RANKL. The in vitro study was confirm by measuring cell toxicity through MTT assay, tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) activity, pit formation assay, and osteoclast multi nuclei TRAP staining assay through RANKL, p83, JNK and ERK pathways. Findings our in silico and in vitro results strongly indicated that Rg3 has significant inhibitory effects on the osteoclast differentiation (osteoclastogenesis) through the down regulation of RANKL, p38 MAPKs, JNK and ERK pathways. In conclusion, the data presented in this study provides strong evidence to demonstrate that these ginsenosides have osteogenic and anti-osteoclastogenesis properties (osteoprotective) effects both in silico and in vitro, which might be regarded as potential therapeutic agents for management of osteoporosis.

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