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Role of M2 type Macrophages and Substance-P in Wallerian Degeneration and Peripheral Nerve Regeneration 원문보기

  • 초록

    말초신경 손상은 왈러 변성이라고 불리는 일련의 세포적 현상을 유도하며, 이 때 대식세포가 중요한 역할을 한다. 대식세포는 염증성 M1과 상처 치료성과 항염증성의 성격을 가진 M2, 이 두 가지 표현형으로 구분된다. 왈러 변성 발생시 대식세포의 표현형이 정확하게 알려지지 않았기 때문에 우리는 왈러 변성 동안의 대식세포 표현형과 동역학적 변화에 대하여 연구를 진행하였다. 또한 그 결과에 따라 신경전달물질인 물질-P가 왈러 변성과 말초신경의 재생에 있어서 어떠한 효과를 일으킬지에 대하여 알아보았다. 왈러 변성 동안 대식세포의 표현형과 역할에 대해 밝히기 위하여, 성체 SD 랫의 좌골 신경에 5mm 길이에 해당하는 절단 부분을 유도하였고 5시간, 8시간, 1일, 3일, 7일, 14일, 35일 이후에 손상 부위보다 말단의 부분을 추출하였다. 손상 이후, 전신에 걸쳐서 면역반응이 유도되었다. 역전사 중합 연쇄 반응 분석에 따르면, 염증성 사이토카인인 iNOS의 mRNA가 수술군 뿐만 아니라 sham 대조군에서 손상 후 5시간과 8시간 이후에 발현되었지만, 1일째에 사라지는 것을 발견하였고, 형광면역염색에 의해서는 1일부터 35일째까지 동안 수술군과 sham 대조군 모두에서 발견되지 않았다. 이와 대조적으로, M2 대식세포 유도 유전자인 galectin3, apolipoprotein E (ApoE), PPAR- γ와 M2 대식세포 마커인 CD206은 정상군에서도 나타났기 때문에 이를 근거로 정상적인 상태에서 조직에 존재하는 대식세포의 표현형이 M2일 것이라 예상하였다. 형광면역염색 분석에서 CD68과 CD206 마커에 동시에 양성인 M2 대식세포는 모든 시간 포인트에 걸쳐서 수술군과 sham 대조군에 나타났고 수술군에서 이 세포들의 수는 수술 이후 3일째부터 증가하기 시작하여 14일째에 이르러서는 가장 높게 증가하였으며 그 이후 감소하였다. 말초 신경 절단 이후 엑손은 3일째부터 변성과정을 겪었고 14일째까지 계속되었으나, 대부분의 엑손은 이미 이른 시간대에 변성되어 사라졌고 이때 CD206에 양성인 침투된 세포들도 가장 높은 비율로 그 수가 증가되어 있었다. 반면, 슈반세포의 수의 증가율은 시간이 증가함에 따라 증가하는 양상을 보였고 14일째에 그 수가 가장 높게 나타났다. 마침내 35일에 이르러서는 신경의 변성 상태가 재생 상태로 전환되었다. 이에 따라 M2대식세포가 말초신경 손상 이후 왈러 변성 동안 주된 표현형이며, 엑손을 제거하는데 있어서 주요한 역할을 하는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 근거로 하여 왈러 변성동안 물질-P가 대식세포의 표현형을 M2로 유도하고 신경의 재생을 촉진하는 효과를 가져오는지에 대하여 생체 조건에서 연구를 진행하였다. 마찬가지로 성체 SD 랫의 좌골 신경을 절단한 뒤 신경상에 2.5mm의 빈 공간이 생성되도록 하였고 이를 매개물 처리군, 물질-P 처리군 이 두 가지 군으로 나누었다. 물질-P의 주사는 수술 이후 즉시, 1일 후, 2일 후 3번에 걸쳐 진행되었으며, 5일과 14일 이후 간격을 포함한 절단된 말초신경을 추출하였다. 물질-P 처리군에서 5일 이후 왈러 변성이 진행되고 있는 말초 신경의 CD68 양성 세포의 수가 감소하였고 M2 대식세포의 모든 대식세포에 대한 비율은 명백하진 않았지만 약간 증가하였다. 또한 엑손의 재생이 일어나는 14일 째의 물질-P를 처리한 말초신경에서 CD68 양성 세포의 수는 대조군에 비하여 약간 감소하였고 M2 대식세포의 비율은 약간 증가하였으며 엑손의 마커인 NF200에 양성인 면적을 비교하였을 때, 물질-P를 처리한 신경에서 그 면적이 대조군보다 높았으며, 이미지상에서도 엑손이 더욱 굵고 곧게 뻗은 것을 확인하였다. 따라서, 물질-P의 처리가 신경 손상 이후에 대식세포의 활성화를 억제하고 신경의 재생을 유도할 수 있다는 가능성을 확인하였다.


    Peripheral nerve injury induces a cascade of cellular events called Wallerian degeneration (WD), where macrophages play a key role. While macrophages are classified toward two phenotypes, M1, which is pro-inflammatory, and M2 that is anti-inflammatory and wound healing. Because the exact macrophage phenotype in WD is not well established, we studied macrophage phenotypes and their kinetics in WD. And based on the results, we also investigated the effects of neuropeptide substance P (SP) in WD and peripheral nerve regeneration. To identify macrophages phenotypes and their role in WD, a 5mm gap was created in the sciatic nerve of adult SD rats, and the distal segment was harvested after 5 hr, 8 hr, 1 day, 3 days, 7 days, 14 days and 35 days. After injury, immune response was up-regulated systemically. By the RT-PCR analysis, the pro-inflammatory cytokine, inducible nitric oxide synthase (iNOS) mRNA was expressed 5 hr and 8 hr at injured also sham-operated groups yet diminished 1 day and not detected by immunofluoresence from day1 to day 35 in both transected and sham-operated groups. By contrast, M2 macropahges modulating genes such as galectin3, apolipoprotein E (ApoE), PPAR- γ and CD206 was expressed at even normal sciatic nerve so we supposed that tissue resident macrophages show M2 phenotype in normal sciatic nerve. By immunofluorescence analysis, CD68 and CD206 double positive M2 macrophages appeared though all time points at injured and sham-operated groups and their cell numbers increased from day 3, peaked in day 14 and decreased in injured nerve. After nerve transection, axons underwent degeneration from day 3 and it continued until day 14 but the most axonal filaments degenerated at early time when the number of CD206 positive cells infiltrated in the highest rate. In contrast, the increase rate of Schwann cell numbers rose over time and the highest rate occurred on day 14. Finally, axonal degeneration state turned into regeneration 35 days after transection. Thus, we confirmed that macrophages show M2 phenotype predominantly in WD after peripheral nerve injury and play a major role in eliminating axons. Based on our results, we explored the effect of SP mediated induction of macrophage phenotype into M2 during WD and axonal regeneration in vivo. The adult SD rats were subjected to sciatic nerve transection to create 2.5mm gap and divided into two groups: vehicle group and SP group. SP injection was performed immediately, day 1 and day 2 and nerves which containing gap were harvested at day 5 and day 14. In the SP treatment group, at day 5, CD68+ cells were reduced and the proportion of M2 macrophages increased insignificantly while WD was occurring. When axons regenerated, CD68+ cells were also reduced but the ratio of CD206+ macrophages to CD68+ activated macrophages was increased slightly and NF200+ area was increased in the SP-treated group at day 14 compared to the vehicle group and axons showed more thick and straight shapes in SP treated group. In conclusion, SP treatment inhibits activation of macrophages and it may induce nerve regeneration.


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