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학위논문 상세정보

Ultra-Deep Pyrosequencing을 이용한 HIV 일차약제내성 돌연변이의 검출 원문보기
Detection of Primary Drug Resistance Mutation Using Ultra-Deep Pyrosequencing

  • 저자

    조민철

  • 학위수여기관

    울산대학교

  • 학위구분

    국내박사

  • 학과

    의학전공 진단검사의학

  • 지도교수

    오흥범

  • 발행년도

    2014

  • 총페이지

  • 키워드

  • 언어

    kor

  • 원문 URL

    http://www.riss.kr/link?id=T13540291&outLink=K  

  • 초록

    연구목적 Antiretroviral therapy (ART)가 도입된 이후에 HIV 감염환자의 사망률(mortality)과 이환률(morbidity)이 크게 감소하였다. 하지만 이들 약제에 대한 내성 돌연변이의 출현으로 인해 치료를 실패하는 경우가 발생하고 있다. 또한 치료를 받은 적이 없는 환자에서도 약제내성 돌연변이가 발견되어 치료에 어려움을 주고 있는데, 이를 '일차내성(primary resistance)' 이라고 한다. 우리나라에서의 일차내성률은 직접염기서열분석을 이용한 소수의 연구에서 4.2~8.8%로 보고되었다. 기존의 DNA 직접염기서열분석은 환자 내에 존재하는 다양한 HIV quasispecies 중 그 빈도가 10% 미만인 minor variant 를 검출하지 못한다는 단점을 가지고 있다. 그런데 10% 미만으로 존재하는 약제내성 돌연변이라 할지라도 약제 투여에 따른 선택압(selective pressure) 에 의해 major variant가 되어 치료 실패에 이를 수 있다. 최근 검사실에 소개되고 있는 ultra-deep pyrosequencing (UDPS) 방법은 10% 미만의 minor variant를 정확히 검출할 수 있는 방법이다. 따라서 이를 이용한 국내 HIV 감염환자의 일차내성률 현황에 대한 조사가 필요할 것으로 여겨진다. 또한 기존의 연구들은 치료를 받은 적이 없는 환자들이긴 했지만 감염 초기의 환자들이 아니었다. 그런데 최근에는 좀 더 이른 시기에 HIV 치료를 시작하도록 하고 있다. 따라서 감염 초기 환자들을 대상으로 한 일차내성률을 조사하는 것도 필요하다. HIV 감염자가 치료받지 않았다 하더라도 보통은 시간이 지남에 따라 환자의 면역상태 약화에 따른 선택압의 감소로 점차 quasispecies의 다양성이 떨어져 일차내성률이 낮게 조사될 수 있다. 본 연구에서는 HIV 일차내성률을 파악하는 UDPS 기법을 확립하고, 치료를 받지 않은 환자군에 기존 연구에서 주로 다루었던 만성 HIV 환자군 뿐만아니라 대부분이 급성기 HIV 감염환자라 할 수 있는 HIV 양성 헌혈자군을 포함하여 1% 이상의 minor variant까지 포함하는 약제내성 현황을 파악하고자 하였다. 연구재료와 연구방법 대한적십자사 혈액수혈연구원으로부터 제공 받은 HIV 양성 헌혈자 혈청검체 25개와 서울아산병원 감염내과에서 진료를 받는 감염 후 1년이상된 치료 받지 않은 는 18명의 만성 HIV 환자의 검체를 대상으로 하였다. 검체들의 HIV-1 바이러스 역가는 모두 10,000 IU/mL 이상이었다. Roche GS-FLX 454 Genome Sequencer platform을 이용하여 UDPS 검사를 하였는데, pol 부위 전영역에서 평균 1,000 x coverage 이상의 염기분석 자료를 얻을 수 있었던 19명의 HIV 양성 헌혈자와 18명의 만성 HIV 환자의 UDPS 자료만을 분석하였다. UDPS에서 1% 이상의 약제내성 돌연변이가 발견되는 경우를 양성으로 판정하였다. Stanford University HIV drug resistance database (http://hivdb.stanford.edu/) 에서 제시한 약제별 내성 아미노산 서열과 비교할 수 있는 전용 프로그램을 개발하여 약제내성 유무를 판단하였고, Stanford University HIV database 알고리즘에 따라 개별 약제에 대한 내성강도 (resistance degree)를 조사하였다. 연구결과 UDPS자료를 분석한 결과 19명의 HIV 양성 헌혈자와 18명의 만성 HIV 환자에서 일차내성률이 각각 63.2% 와 44.4%로 조사되었다. 또한 Stanford University HIV database의 알고리즘에 따라 각 약제별 내성강도 (resistance degree)를 조사하였는데, HIV 양성 헌혈자군과 만성 HIV환자군 모두에서 NRTI 계열 약제들 중 Didanosine (DDI), Stavudine (D4T) 이 높은 mutation penalty score를 보여 내성강도가 강한 약제들로 조사되었다. 반면 Lamivudine (3TC), Emtricitabine (FTC)는 상대적으로 내성강도가 약한 약제들이었다. NNRTI 계열 약제들 중에는 Nevirapine (NVP), Efavirenz (EFV)가 내성강도가 높은 약제들이었고 Etravirine (ETR), Rilpivirine (RPV) 가 내성강도가 약한 약제들이었다. INI 계열 약제 중에는 Raltegravir (RAL), Elvitegravir (EVG)가 강한 내성강도를 보였고 Dolutegravir (DTG) 가 상대적으로 약한 내성강도를 보였다. PI 계열의 약제들은 Fosamprenavir (FPV), Nelfinavir (NFV), Saquinavir (SQV), Lopinavir/ritonavir (LPV/r), Indinavir (IDV), Atazanavir (ATV) 가 강한 내성강도를 보이고 Darunavir (DRV), Tipranavir (TPV)에서 약한 내성강도를 보였다. 결론 본 연구를 통하여 국내 최초로 HIV 일차내성률을 1%의 minor variant 수준까지 정확히 파악할 수 있는 UDPS 방법을 확립할 수 있었다. 또한 본 연구를 통하여 각 약제별로 내성강도를 제공할 수 있는 프로그램을 개발할 수 있었다. UDPS를 이용한 경우 기존의 염기서열분석법보다 검출민감도가 높아 일차내성률이 높게 관찰되었다. 또한 급성기 환자가 다수 포함되었을 것으로 여겨지는 헌혈자군에서는 감염 후 1년 이상된 만성 감염자에 비해 내성률이 더 높다는 것도 확인할 수 있었다. 최근에는 HIV 감염자에 대한 조기치료가 권장되는 쪽으로 치료 경향이 변경되고 있다. 따라서 본 연구의 결과는 치료를 시작하기 전에 약제내성 검사를 반드시 시행해야 한다는 것을 지지하는 것이다. UDPS를 통해 검출한 10% 미만의 minor resistant variant가 실제 임상적 내성을 보일지에 대해서는 더 많은 연구가 필요할 것이다. 그러나 치료직전에 high-level resistance 를 보이는 약제에 대한 사전정보는 치료방침 수립에 크게 도움이 될 것이다. 결론적으로 본 연구를 통해 확립한 UDPS 기법과 약제내성 분석용 전용프로그램은 HIV 감염자에서의 약제별 일차내성을 정확하고 민감하게 파악할 수 있게 해줄 수 있다. 또한 본 연구에서 파악한 약제별 내성강도 정보는 추후 임상연구 및 국내 HIV 환자관리를 위한 정책수립과 치료방침 수립에 많은 도움이 될 것이다.


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