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방사선저항성과 관련된 DNA 손상복구 신호전달과정에서 siRNA를 이용한 핵심 인자 규명 원문보기
Identifying Key Molecules of Radioresistance by Controlling DNA Damage Repair-related Genes Using siRNA

  • 저자

    최원식

  • 학위수여기관

    울산대학교

  • 학위구분

    국내박사

  • 학과

    의학과 방사선종양학

  • 지도교수

    이상욱

  • 발행년도

    2014

  • 총페이지

    38 p.

  • 키워드

    방사선저항성 DNA 손상복구 RNA 간섭 siRNA;

  • 언어

    kor

  • 원문 URL

    http://www.riss.kr/link?id=T13540349&outLink=K  

  • 초록

    연구목적 암세포에서 방사선조사에 의한 DNA 손상이 발생하면 DNA 손상복구 과정이 유도되어 암세포사멸이 억제될 수 있다. 이러한 방사선에 대한 암세포의 저항성은 방사선치료 실패의 주요 원인 중 하나로 알려져 있다. 본 연구에서는 방사선에 저항성을 나타내는 암세포주를 대상으로, DNA 손상복구에 관여하는 주요 단백질을 siRNA를 이용하여 그 발현을 억제하였을 때, 효과적으로 방사선반응도가 증가되는지를 확인함으로써 주요 인자를 규명하고자 하였다. 재료 및 연구방법 다양한 폐암, 대장암, 두경부암 세포주를 대상으로, 세포주별 방사선 반응도를 집락형성 분석법을 이용해 측정하여 방사선에 저항성을 나타내는 세포주를 확인하였고, 저항성을 보이는 각 세포주별 DNA 손상복구 관련 단백질의 발현량을 western blot을 이용하여 측정하였다. 문헌조사를 통하여 DNA 손상복구 과정의 대표적인 경로 (NHEJ, HR, BER/SSBR, Checkpoint) 별로 후보 유전자를 선정하였고, 선정한 유전자 별로 5종씩의 siRNA를 제작하여 real-time PCR를 통해 억제효율을 검증하였으며, 각 세포주에 대한 최적의 형질주입 방법을 정립하였다. 효율성이 검증된 siRNA로 개별 유전자를 억제하고 방사선 조사를 병용했을 때 각 세포주에서의 세포생존율을 비교 평가하였다. 또한, DNA 손상복구를 최대한 억제하기 위해 서로 다른 DNA 손상복구 경로에 속하는 개별 유전자에 대해 2종의 siRNA를 조합하여 동시에 억제하고 방사선조사를 병용했을 때의 세포생존율을 평가하였다. 결과 폐암 세포주에서는 A549, 대장암 세포주에서는 HT29 세포주가 가장 높은 방사선 저항성을 나타내었고, 여러 DNA 손상복구 관련 단백질 발현량이 높음을 확인하였다. 문헌조사를 통해 선정된 총 17개의 후보 유전자에 대하여 각각 5종의 siRNA를 제작하여 효율성을 검증한 결과, 11개의 유전자에서 억제효율이 80% 이상인 siRNA를 확인할 수 있었으며, 그 중 가장 높은 억제효율을 보인 11종의siRNA 염기서열을 확보하였다. A549, HT29, 그리고 두경부암 세포주인 HN-9 세포주를 대상으로 siRNA 형질주입방법을 비교한 결과, A549 세포주에선 G-Fectin, HT29 세포주에선 Lipofectamine 2000, 그리고 HN-9 세포주에선 두 시약 모두 사용 가능한 것으로 나타났다. A549, HT29, HN-9 세포주에서 확보된 11종의 siRNA를 이용하여 개별 유전자를 억제한 결과, 모든 세포주에서 공통적으로 SMC1, XRCC1, MDM2, BRCA1을 억제하였을 때 세포생존율이 대조군에 비해 월등히 감소하는 것으로 나타났다. 방사선 조사와의 상승효과를 알아보기 위해, 개별 유전자를 siRNA로 억제하였을 때와 방사선 조사가 병용 처리되었을 때의 세포생존율을 비율로 평가해 본 결과, 각 세포주에서 다른 양상으로 방사선민감도가 증가하는 것으로 나타났다. A549 세포주에서는 거의 모든 경로에서, 방사선 조사 단독으로 처리하는 것보다는 병용처리 되었을 때 세포사멸이 증가하였고, HN-9 세포주에서는 HR 관련 유전자를 억제하였을 때 다른 경로를 차단하는 것보다 세포사멸이 더 유도되었다. 공통적으로 3종의 세포주 모두에서 RAD51과 SMC1의 억제가 방사선 조사와의 상승효과를 보여주었으며, 특히 SMC1을 억제하고 방사선 조사를 병용했을 때 모든 세포주에서 10% 이내로 세포생존율을 낮추는 것으로 나타났다. HN29 세포주를 대상으로 서로 다른 경로에 속하는 개별 유전자에 대한 2종의 siRNA 조합억제를 시행하여 평가한 결과, 8종류의 조합억제 형태 모두에서 20% 이내로 세포생존율이 감소하였지만, 방사선 조사와의 뚜렷한 상승효과는 확인할 수 없었다. 결론 방사선에 저항성을 나타내는 3종의 세포주를 대상으로, 대표적인 DNA 손상복구 경로 별로 선정한 관련 유전자를 효율성을 검증한 siRNA를 이용하여 억제한 결과, 공통적으로 SMC1, XRCC1, MDM2, BRCA1을 억제하였을 때 세포생존율이 뚜렷하게 감소하였고, 방사선 조사가 병용 처리되었을 때 RAD51과 SMC1의 억제가 공통적으로 방사선 조사와의 상승효과를 보여주었다. 특히, SMC1의 억제와 방사선 조사를 병용하는 것이 공통적으로 10% 이내로 세포생존율을 감소시키는 것으로 나타나, SMC1을 방사선민감제 개발의 좋은 핵심인자로 제시 할 수 있을 것이다.


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