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시험관내에서 합성한 오이모자이크 바이러스 RNA단편을 성공적으로 절단한 ribozyme의 식물체내의 발현
Expression of in vitro-tested ribozyme against cucumber mosaic virus RNA in tobacco plant

박상규    (대구대학교 농화학과  );
  • 초록

    시험관내에서 합성한 오이모자이크 바이러스 RNA단편을 성공적으로 절단한 ribozyme (한국농화학회지 37: 56-63(1994))을 담배 식물체에 발현시켜 바이러스 저항성 식물체를 만들려고 하였다. 해당 ribozyme의 염기서열을 함유한 DNA 단편을 꽃양배추 바이러스 35S promoter와 nopaline 합성효소 terminator에 연결시키고 연결 부위 및 ribozyme의 염기서열을 확인하였다. 염기서열을 확인한 합성유전자를 Agrobacterium tumefaciens LBA4404에 합성유전자를 함유한 E. coli HB101을 E. coli HB101(pRK2073)를 helper로 Agrobacterium tumefaciens LBA4404와 함께 배양하는 tri-parental mating system을 이용하여 도입시켰다. Ribozyme 유전자를 함유한 Agrobacterium 세포를 담배잎 조각과 함께 배양한 후 항생제인 kanamycin을 함유한 MS 배지에서 자란 열개의 작은 식물체를 재분화하였다. 형질전환한 식물체내에 ribozyme 유전자가 존재하는지의 여부는 합성효소증폭반응(PCR)을 이용하였던바, 일곱개체가 예상된 570 염기쌍의 DNA 단편을 가지고 있었다. 이들 중 네 개체로부터 RNA을 분리하여 formamide를 함유한 agarose에서 전기영동한 후 35S-ribozyme-nos의 DNA 단편으로 Northern hybridization을 행하였던 바, 식물세포내의 nuclease에 의해 ribozyme RNA가 분해된 듯 감지 할 수 없었다. 따라서 ribozyme을 이용하여 바이러스 저항성 식물체를 얻으려면 nuclease에 의해 분해되지 않는 ribozyme이 필요할 것으로 사료된다.


    In vitro-tested ribozyme against synthesized cucumber mosaic virus (CMV) RNA (Agric. Chem. & Biotech. 37:56-63(1994)) was expressed in tobacco plant to develop virus resistant plants. The ribozyme sequence was linked to cauliflower mosaic virus 35S promoter and nopaline synthase(nos) terminator and this chimeric 35S-ribozyme-nos gene was sequenced. The sequenced chimeric gene was transferred to Agrobacterium tumefaciens LBA4404 using tri-parental mating system. The E. coli HB101 containing chimeric gene was incubated with E. coli HB101(pRK2073) as a helper and Agrobacterium tumefaciens LBA4404. Then Agrobacterium cells containing the ribozyme construct was cocultivated with tobacco leaf pieces. Ten different plants were regenerated from kanamycin containing MS medium. The presence of the ribozyme construct in the transgenic tobacco plants was confirmed by polymerase chain reaction (PCR). Seven different transgenic plants in ten different kanamycin resistant plants showed the expected size (570 base pairs) of 35S-ribozyme-nos gene fragment. Total RNAs were isolated from four different transgenic plants and separated on a 1% agarose gel containing formamide. Northern hybridization with 35S-ribozyme-nos gene fragment as a probe indicated that ribozyme transcripts may be degraded tv nuclease. Therefore, nuclease-resistant ribozymes are needed for the development of virus-resistant transgenic plants using ribozymes.


  • 주제어

    Hammerhead ribozyme .   CMV .   Transgenic plants.  

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    1. 1994 "인공적으로 합성한 오이모자이크 바이러스 RNA의 헤머헤드 ribozyme에 의한 시험관내에서의 절단" 한국농화학회지 = Journal of the Korean society of Agricultural Chemistry and Biotechnology 37 (1): 56~63    
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    3. 1996 "감자의 단백질 분해효소 억제제 II 유전자의 특별한 염기서열의 자연적 제거로 인한 상처 유발성 발현의 소실" 한국농화학회지 = Journal of the Korean society of Agricultural Chemistry and Biotechnology 39 (2): 104~111    
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    5. 1997 "Direct Headspace Sampling 방법을 이용한 당근의 휘발성 Terpenoids 분석에 관한 연구" 한국농화학회지 = Journal of the Korean society of Agricultural Chemistry and Biotechnology 40 (6): 536~540    
    6. 1998 "PCR과 Southern hybridization을 이용한 구지뽕나무와 무궁화의 클론감별" 한국농화학회지 = Journal of the Korean society of Agricultural Chemistry and Biotechnology 41 (1): 42~46    
    7. 2001 "미량원소 엽면 처리에 의한 엽채류의 질산태 질소 축적 억제" 한국농화학회지 = Journal of the Korean society of Agricultural Chemistry and Biotechnology 44 (4): 240~245    
    8. 2001 "Suppression of Nitrate Accumulation in Lettuce by Application of Mg and Micronutrients" 한국환경농학회지 = Korean journal of environmental agriculture 20 (5): 340~345    
    9. 2002 "시금치 nitrate reductase cDNA 클로닝 및 염기서열 분석" 한국농화학회지 = Journal of the Korean society of Agricultural Chemistry and Biotechnology 45 (3): 129~133    
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