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조효소를 함유하지 않는 효모의 Homocysteine 분해효소, Cystathionine ${\beta}$-Synthase의 생화학적 특성
Biochemical Characteristics for the Cofactor Free Mutant of Yeast Homocysteine Catalyzing Enzyme, Cystathionine ${\beta}$-Synthase

지광한   (금오공과대학교 자연과학부 응용화학UU0000297  ); 조현남   (금오공과대학교 자연과학부 응용화학UU0000297  ); 양선아   (계명대학교 전통미생물자원개발 및 산업화연구센터UU0000145  ); 이인선   (계명대학교 전통미생물자원개발 및 산업화연구센터UU0000145  );
  • 초록

    본 연구에서는 최근 심혈관 순환계의 새로운 위험인자로 등장한 homocysteine을 생체 내에서 전환시키는 효소인 cystathionine ${\beta}$ -synthase의 돌연변이에 관한 연구를 수행하였다. 인간의 cystathionine ${\beta}$ -synthase에 돌연변이가 생기면 그 효소활성에 문제가 발생하여 homocysteine이 생체에 축적되어 부작용을 일으키는 homocystinuria라는 유전병이 생기게 되는데 여러 돌연변이 중 G3O7이 serine으로 치환된 돌연변이가 많은 비중을 차지한다. 한편 인간의 cystathionine ${\beta}$ -synthase는 heme을 prosthetic group로 가지고 있어서 여러 스펙트럼 연구에 장애가 있으나, 같은 기능을 갖고 인간의 cystathionine ${\beta}$ -synthase와 높은 상동성를 가지는 효모 유래의 cystathionine ${\beta}$ -synthase는 heme을 포함하고 있지 않아 스펙트럼 연구에 용이한 점을 이용하여 인간의 G3O7에 해당하는 G247의 부위를 serine으로 치환, 정제하여 그 생화학적 특성을 살펴보았다. 효모의 G247S는 C 말단이 잘린 truncated form과 전체단백질이 모두 함유된 full length form의 두 가지를 이용하여 실험하였다. 두 돌연변이 단백질 모두에서 기질로써 L-homocysteine과 L-serine을 이용한 방사선 동위원소 $C^{14}$ 을 사용하여 활성을 측정한 바 활성이 전혀 검출되지 않았으며 ${\beta}$ -mercaptoethanol과 L-cysteine을 기질로 이용한 방법에서도 황화수소를 검출할 수 없었다. 또한 UV-visible spectrum과 CD spectrum에서도 PLP의 특이적인 흡수지대인 410 nm에서의 흡수를 전혀 검출 할 수 없었다. 또한 PLP의 검출방법인 KCN과의 incubation실험에서도 PLP를 검출할 수 없었다. 보고된 인간 cystathionine ${\beta}$ -synthase 결정3차 구조를 분석하여 본 바, G307은 조효소 PLP의 근방에 위치하여 bulky한 R group인 serine으로 치환될 경우 효소와 PLP의 결합을 극도로 저지하여 활성을 저지하는 것으로 생각된다 G247S를 고농도의 PLP와 incubation하여도 활성이 회복되지 않으며 단백질로의 PLP의 incorporation이 관찰되지 않았다. 이는 인간의 G307S환자가 PLP를 투여하여도 병세의 호전이 없는 이유를 설명하고 있다. 결론적으로 G307S 돌연변이에 기인한 homocystinuria 환자는 CBS의 활성이 전무하며 PLP의 투여에도 효과가 없음이 효모를 이용한 본 연구에서 확인되었다.


    Mutations in the cystathionine ${\beta}$ -synthase (CBS) gene cause homocystinuria, the most frequent inherited disorder in sulfur metabolism. CBS is the unique enzyme using both heme and pyridoxal 5-phosphate (PLP) for activity. Among the reported 140 mutations, one of the most common disease-causing alterations in human CBS is G307S mutation. To investigate the pathogenic mechanism of G307S by spectroscopic methods, we engineered the full length and the truncated G247S mutation of yeast CBS that is corresponding mutation to human G307S. Yeast CBS does not contain heme and thus gives a merit to study the spectroscopic properties. The UV-visible spectra of the purified full length and the truncated G247S yeast CBSs showed the total absence of PLP in the protein. The absence of PLP in G247S mutation was also confirmed by the PLP-cyanide adduct formation experiment, which was conducted by the incubation of the purified enzyme with KCN. The adducts were detected using a circular dichroism (CD) and a spectrofluorimeter. Radio isotope activity assay of full length and truncated G247S proteins also gave no activity. Our yeast G247S mutation data suggested that G307S might make the distortion of the active site so that cofactor PLP and substrate can not fit inside the active site. Our yeast CBS study addressed the reason why the G307S mutation in human CBS makes the enzyme inactive that consequently leads to severe clinical phenotype.


  • 주제어

    Homocysteine .   Cystathionine ${\beta}$-synthase .   Mutant .   PLP.  

  • 참고문헌 (20)

    1. Ellman, G. L. 1959. Tissue sulfhydryl groups. Arch. Biochem. Biophys. 82: 70-77 
    2. Gallagher, P. M., P. Ward, S. Tan, E. Naughten, J. P. Kraus, G. C. Sellar, D. J. McConnell, I. Graham, and A. S. Whitehead. 1995. High frequency (71 %) of cystathionine $\beta$-synthase mutation G307S in Irish homocystinuria patients. Hum. Mutat. 6: 177-180 
    3. Seshadri, S., A. Beiser, J. Selhub, P. F. Jacques, I. H. Rosenberg, R. B. D'Agostino, P. W. Wilson, and P. A. Wolf 2002. Plasma homocysteine as a risk factor for dementia and Alzheimer's disease. N Engl. J. Med. 346: 476-483 
    4. Wierzbicki, A. S. 2007. Homocysteine and cardiovascular disease: a review of the evidence. Diab. Vase. Dis. Res. 4: 143-150 
    5. Jhee, K. H., P. McPhie, and E. W. Miles. 2000. Yeast cystathionine $\beta$-synthase is a pyridoxal phosphate enzyme but, unlike the human enzyme, is not a heme protein. J. Biol. Chem. 275: 11541-11544 
    6. Drummond, J. T., J. Jarrett, J. C. Gonzalez, S. Huang, and R. G. Matthews. 1995. Characterization of nonradioactive assays for cobalamin-dependent and cobalamin-independent methionine synthase enzymes. Anal. Biochem. 228: 323-239 
    7. Kruger, W. D. and D. R. Cox. 1994. A yeast system for expression of human cystathionine $\beta$-synthase: structural and functional conservation of the human and yeast genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 6614-6618 
    8. Chen, X., K. H. Jhee, and W. D. Kruger. 2004. Production of the neuromodulator $H_2S$ by cystathionine $\beta$-synthase via the condensation of cysteine and homocysteine. J. Biol. Chem. 279: 52082-52086 
    9. Miles, E. W. and J. P. Kraus. 2004. Cystathionine $\beta$-synthase: structure, function, regulation, and location of homo cystinuriacausing mutations. J. Biol. Chem. 279: 29871-29874 
    10. Meier, M., M. Janosik, V. Kery. J. P. Kraus, and P. Burkhard. 2001. Structure of human cystathionine $\beta$-synthase: a unique pyridoxal $5^+$-phosphate-dependent heme protein. J. EMBO. 20: 3910-3916 
    11. Thee, K. H. and W. D. Kruger. 2005. The role of cystathionine $\beta$-synthase in homocysteine metabolism. Antioxid. Redox. Signal. 7: 813-822 
    12. Shan, X. and W. D. Kruger. 1998. Correction of diseasecausing CBS mutations in yeast. Nat. Genet. 19: 91-93 
    13. Kim, J., M. K. Park, E. Kim, C. Han, S. A. Jo, and I. Jo. 2007. Plasma homocysteine is associated with the risk of mild cognitive impairment in an elderly Korean population. J. Nutr. 137: 2093-2097 
    14. Mudd, A. H., J. D. Finkelstein, and F. Irrevere. 1964. Homocystinuria: an enzymatic defect. Science. 143: 1443-1445 
    15. Jhee, K. H., P. McPhie, and E. W. Miles. 2000. Domain architecture of the heme independent yeast cystathionine $\beta$-synthase provides insights into mechanisms of catalysis and regulation. Biochemistry. 39: 10548-10556 
    16. Kraus, J. P., M. Janosik, V. Kozich, R. Mandell, V. Shih, M. P. Sperandeo, G Sebastio, R. de Franchis, G Andria, L. A. Kluijtmans, H. 810m, G H. Boers, R. B. Gordon, P. Kamoun, M. Y. Tsai, W. D. Kruger, H. G. Koch, T. Ohura, and M. Gaustadnes. 1999. Cystathionine $\beta$-synthase mutations in homocystinuria. Hum. Mutat. 13: 362-375 
    17. Pezzini, A., E. Del Zotto, and A. Padovani. 2007. Homocysteine and cerebral ischemia: pathogenic and therapeutical implications. Curr. Med. Chem. 14: 249-263 
    18. Linnebank, M., A. Homberger, R. Junker, U. Nowak-Goettl, E. Harms, and H. G Koch. 2001. High prevalence of the 1278T mutation of the human cystathionine beta-synthase detected by a novel screening application. Thromb. Haemost. 85: 986-988 
    19. Adams, E. 1979. Fluorometric determination of pyridoxal phosphate in enzymes. Method. Enzymol. 62: 407-410 
    20. Kruger, W. D., L. Wang, K. H. Jhee, R. H. Singh, and L. J. Elsas 2nd. 2003. Cystathionine $\beta$-synthase deficiency in Georgia (USA): correlation of clinical and biochemical phenotype with genotype. Hum. Mutat. 22: 434-441 
  • 이 논문을 인용한 문헌 (1)

    1. Cho, Hyun-Nam ; Fan, Lu-An ; Yoo, Dong-Chan ; Yang, Seun-Ah ; Lee, In-Seon ; Kim, Jae-Hyung ; Baek, Hyo-Hyun ; Jhee, Kwang-Hwan 2008. "The MALDI-TOF MS determination of yeast proteins producing $H_2S$" 한국생물공학회지 = Korean journal of biotechnology and bioengineering, 23(5): 425~430     

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