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종양억제단백질 Nm23-H1 발암억제 기전연구
Investigation of the mechanism of Nm23-H1 metastasis-inhibitory activity

  • 사업명

    국립암센터연구소지원

  • 과제명

    종양억제단백질 Nm23-H1 발암억제 기전연구

  • 주관연구기관

    충북대학교
    Chungbuk National University

  • 연구책임자

    하현정

  • 보고서유형

    최종보고서

  • 발행국가

    대한민국

  • 언어

    한국어

  • 발행년월

    2009-03

  • 과제시작년도

    2008

  • 주관부처

    보건복지가족부

  • 사업 관리 기관

    한국보건산업진흥원
    Korea Health Industry Development Institute

  • 등록번호

    TRKO201000000424

  • 과제고유번호

    1355059046

  • 키워드

    종양억제단백질 Nm23-H1.단백질 상호작용.세포의 죽음.Nm23-H1.protein-protein interaction.apoptosis.p53.TGF-β.

  • DB 구축일자

    2013-04-18

  • 초록 


    Purpose:
    This study is focused on the isolation and characterization of potential regulators positively or negatively controll...

    Purpose:
    This study is focused on the isolation and characterization of potential regulators positively or negatively controlling apoptosis, growth factor-induced signaling, and p53 activity through Nm23-H1 protein network, In addition, the understanding of Nm23-H1-mediated cross-talk within cells could be helpful for developing an effective therapies that may be involved in the diseases, which are possibly defective in Nm23-H1 protein network.
    Content and methods:
    (1) Establishment and characterization of Nm23-H1 protein network; investigation of potential Nm23-H1-interacting proteins (STRAP, ZPR9, Smads, MPK38, MST1, Daxx, and MIF).
    (2) Isolation of potential regulators controlling p53 activity and investigation of synergistic effect between Nm23-H1 and other tumor suppressors such as p53.
    (5) Identification of the potential regulators that are involved in apoptosis and cell growth through Nm23-H1 protein network; providing a useful basis for anti-cancer drug
    development.
    To do this study, we used the following methods; in vivo binding assay, native gel analysis, reporter assay, apoptosis assay, cell growth assay, immunofluorescence staining and FACS analysis, siRNA experiment, ubiquitination assay, generation of stable overexpression and knockdown cell lines, and preparation of recombinant proteins
    Results: This work is summarized as follows.
    Nm23-H1 tumor suppressor physically interacts with STRAP, a TGF-$\beta$ receptor interacting protein, and negatively regulates TGF-$\beta$ signaling (1st year);
    (1) Nm23-H1 physically interacts with STRAP in vivo
    (2) Cysteine residues, especially $Cys^{152}$ and $Cys^{270}$ of STRAP and $Cys^{145}$ of Nm23-H1, play a critical role in the association of Nm23-H1 and STRAP in vivo.
    (3) STRAP binds to Nm23-H1 through $Cys^{152}$, within the fourth WD40 repeat, and $Cys^{270}$, within the sixth WD40 repeat.
    (4) The Cys to Ser mutations of both Nm23-H1 and STRAP do not alter the normal function of these proteins.
    (5) Nm23-H1 physically associates with STRAP and potentiates STRAP-induced inhibition of TGF-$\beta$ signaling.
    (6) Nm23-H1 is involved the negative regulation of TGF-$\beta$-induced apoptosis and growth inhibition through an inhibition of TGF-$\beta$ signaling.
    (7) Nm23-H1 prevents the translocation of Smad3 from the cytoplasm to the nucleus in response to TGF-$\beta$.
    (8) STRAP potentiates Nm23-H1-induced cell growth.
    Nm23-H1 tumor suppressor and its interacting partner STRAP activate p53 function (2nd year);
    (1) Nm23-H1 and STRAP physically interact with p53 in vivo.
    (2) Complex formation between Nm23-H1 and p53 and between STRAP and p53 requires cysteine residues present in each of the two proteins.
    (3) The interaction between Nm23-H1 and p53 or STRAP and p53 appears to be dependent on stimulation by 5FU or doxorubicin.
    (4) Nm23-H1 and its interacting partner STRAP physically associate with p53 and enhance p53 activity.
    (5) Nm23-H1 and STRAP activate p53 function through the stimulation of the nuclear translocation of p53.
    (6) Nm23-H1 and STRAP stimulate p53 activity by the removal of Mdm2 from the p53-Mdm2 complex.
    (7) Nm23-H1 and STRAP induce p53-mediated apoptosis and cell cycle arrest.
    Direct interaction between Nm23-H1 and macrophage migration inhibitory factor (MIF) is critical for alleviation of MIF-mediated suppression of p53 activity (3rd year);
    (1) Nm23-H1 physically associates with MIF in vivo.
    (2) cysteine residues, particularly $Cys^{145}$ of Nm23-H1 and $Cys^{60}$ of MIF, play an essential role in the association of Nm23-H1 and MIF in vivo.
    (3) The interaction between Nm23-H1 and MIF is dependent on p53 stimulation by 5FU or doxorubicin.
    (4) Nm23-H1 alleviates MIF-mediated suppression of p53-induced transcription by destabilizing MIF-p53 complexes.
    (5) Nm23-H1 stimulates the removal of Mdm2 from p53-Mdm2 complexes.
    (6) Nm23-H1 inhibits MIF-induced cell proliferation in quiescent NIH 3T3 fibroblasts.
    Usefulness:
    The demonstration that Nm23-H1 is functionally associated with TGF-$\beta$ and p53 signaling through direct interaction with STRAP, p53, and MIF may contribute to the understanding of the molecular mechanism for tumor suppressors, leading to the development of new anti-cancer drugs.


    연구목표:
    암전이 억제단백질인 Nm23-H1 단백질네트웍 연구를 통해 세포사멸 및 growth factor-induced
    signaling을 제어하고, p53 활성도 조절에 있어 positive/negative 효과를 줄...

    연구목표:
    암전이 억제단백질인 Nm23-H1 단백질네트웍 연구를 통해 세포사멸 및 growth factor-induced
    signaling을 제어하고, p53 활성도 조절에 있어 positive/negative 효과를 줄 수 있는 세포내 조절 후보인자를 탐색 동정하여 Nm23-H1 및 네트웍 구성인자들의 직 간접적 세포내 조절이상으로 유발되는 다양한 암 발생에 대한 억제기전을 새롭게 규명함으로써 항암효과를 극대화할 수 있는 신약개발에 대한 원천기반기술을 제공하고 져 함.
    연구내용 및 방법:
    (1) Nm23-H1 세포내 단백질네트웍 구축 및 분석; 구성인자 분석 (STRAP, ZPR9, Smads, MPK38, MST1, Daxx, MIF 등).
    (2) Nm23-H1 세포내 단백질 네트웍을 이용한 p53 activity 조절자 동정 및 발암억제 단백질간의 시너지 효과분석.
    (3) Nm23-H1 세포내 단백질 네트웍을 이용한 세포의 사멸 및 촉진 신호전이 조절자 규명; Nm23-H1 을 축으로 한 신규 발암억제 기전분석을 통한 신규 또는 개량된 발암억제 후보물질 도출.
    연구내용을 수행하기 위한 방법으로는 in vivo binding assay, native gel analysis, reporter assay, apoptosis assay, cell growth assay, immunofluorescence staining and FACS analysis, siRNA experiment, ubiquitination assay, stable overexpression 및 knockdown cell line의 제조, 그리고 재조합 단백질제조 실험방법등을 사용하였음.
    연구결과:
    1 차년도 연구결과; 암전이 억제 단백질 Nm23-H1 은 TGF-$\beta$ receptor 결합단백질의 하나인 STRAP와 결합하여 TGF-$\beta$ signaling을 억제함.
    (1) Nm23-H1은 실제로 세포내에서 STRAP와 상호결합 함.
    (2) STRAP 시스테인 152번/270번와 Nm23-H1 시스테인 145번이 두 단백질간의 결합에 기여함.
    (3) STRAP 시스테인 152번/270번은 STRAP의 4번째와 6번째 WD40 repeat 도메인에 존재함.
    (4) Nm23-H1 와 STRAP의 시스테인 -> 세런 mutant들은 이들 단백질의 정상적인 생리기능에는 아무런 영향을 미치지 않았음.
    (5) Nm23-H1/STRAP 결합은 STRAP-induced inhibition of TGF-$\beta$ signaling을 더욱 증대시킴.
    (6) Nm23-H1은 TGF-$\beta$-induced apoptosis and growth를 억제하는 효과를 나타냄.
    (7) Nm23-H1은 Smad3 핵으로의 이동을 감소시켜 TGF-$\beta$ 신호전달을 감소시킴.
    (8) STRAP은 Nm23-H1-induced cell growth을 더욱 증대시킴.
    2차년도 연구결과; Nm23-H1와 결합단백질인 STRAP은 p53 활성화에 기여함.
    (1) Nm23-H1/STRAP 모두 세포내에서 p53과 결합하고 있음.
    (2) Nm23-H1/P53 및 STRAP/P53 결합은 모두 시스테인을 매개로 이루어짐.
    (3) Nm23-H1/P53 및 STRAP/P53 결합은 p53 자극제인 5FU/doxorubicin에 의해 영향을 받음.
    (4) Nm23-H1/P53 및 STRAP/P53 결합은 p53 활성화를 촉진시킴.
    (5) Nm23-H1와 STRAP은 p53 핵 이동을 증가시켜 p53 활성화을 유도함.
    (6) Nm23-H1와 STRAP은 p53/Mdm2 결합체에서 Mdm2 분리를 촉진함.
    (7) Nm23-H1와 STRAP은 p53-mediated apoptosis and cell cycle arrest을 촉진시킴.
    3차년도 연구결과; 전이억제 단백질 Nm23-H1은 macrophage migration inhibitory factor(MIF)와 상호작용을 통하여 MIF를 통한 p53 활성도 저해능력을 방해함.
    (1) Nm23-H1은 세포내에서 MIF와 실제 결합함.
    (2) Nm23-H1 시스테인 145번과 MIF 시스테인 60번이 두 단백질의 결합에 관여함.
    (3) Nm23-H1/MIF 결합은 p53 자극제인 5FU/doxorubicin에 의해 영향을 받음.
    (4) Nm23-H1은 MIF에 의한 p53-induced transcription 억제작용 방해를 MIF/p53 결합체로 부터 MIF를 분리해 냄으로써 수행함.
    (5) Nm23-H1은 p53/Mdm2 복합체에서 Mdm2 분리를 촉진시킴.
    (6) Nm23-H1은 NIH 3T3 세포에서 MIF에 의해 매개되는 세포증식작용을 억제함.
    기대효과:
    Nm23-H1 네트웍 구성인자들이 세포내 signaling pathways와 p53 regulator로써 작용할 수 있는 증명은 이미 본 연구팀에서 발견한 항산화제 PAG가 MIF의 negative regulator로써 작용하는 점과 연관되어 MIF의 세포내 발암기전 규명에 있어 중요한 실마리를 제공해 줄 것으로 사료됨.
    Nm23-H1 세포내 결합단백질의 기능적 분석 및 세포내 상호작용 연구에서 파생되는 국제경쟁력을 갖춘 생화학적 분자생물학적 기초의과학 기반기술의 확립 및 산업적 응용성에 대한 제반 유전공학기술의 제공은 새로운 개념의 신의약품 개발에 필요한 세포내 핵심단백질, 또는 그 단백질 연결망구축 인프라에 크게 기여하게 될 것으로 사료됨.


  • 목차(Contents) 

    1. 표지...1
    2. 제출문...5
    3. 목차...6
    4. I. 연구개발결과 요약문...7
    5. 한글 요약문...7
    6. Project Summery...9
    7. II. 연구개발과제 연구결과 ...11
    8. 1. 연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...11
    9. 2. 연구개발과제...
    1. 표지...1
    2. 제출문...5
    3. 목차...6
    4. I. 연구개발결과 요약문...7
    5. 한글 요약문...7
    6. Project Summery...9
    7. II. 연구개발과제 연구결과 ...11
    8. 1. 연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...11
    9. 2. 연구개발과제의 연구대상 및 방법 ...14
    10. 3. 연구개발과제의 연구개발결과 ...18
    11. 4. 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...26
    12. 5. 연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ...28
    13. 6. 연구개발과제의 활용계획 ...36
    14. 7. 참고문헌 ...38
    15. 8. 첨부서류 ...40
  • 참고문헌

    1. 전체(0)
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    4. 보고서(0)

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