본문 바로가기
HOME> 보고서 > 보고서 검색상세

보고서 상세정보

내생·근권세균을 이용한 환경친화적 고추역병 방제용 미생물살균제 개발
Development of biocontrol agents using antagonistic bacteria against Phytophthora blight of pepper

  • 사업명

    농림기술개발

  • 과제명

    내생·근권세균을 이용한 환경친화적 고추역병 방제용 미생물살균제 개발

  • 주관연구기관

    고려대학교
    Korea University

  • 연구책임자

    김기덕

  • 참여연구자

    천세철   김의남   상미경   오지연   김홍조  

  • 보고서유형

    최종보고서

  • 발행국가

    대한민국

  • 언어

    한국어

  • 발행년월

    2008-04

  • 과제시작년도

    2007

  • 주관부처

    농림부

  • 사업 관리 기관

    농림기술관리센터
    Agricultural Research & Development Promotion Center

  • 등록번호

    TRKO201000008970

  • 과제고유번호

    1385006757

  • DB 구축일자

    2013-04-18

  • 초록 


    Currently, yield and quality of marketable peppers are frequently limited by Phytophthora blight caused by the oomycete pathogen ...

    Currently, yield and quality of marketable peppers are frequently limited by Phytophthora blight caused by the oomycete pathogen Phytophthora capsici in Korea. The control for Phytophthora blight of pepper is dependent on use of chemicals such as metalaxyl, phenlyamide fungicide or fosetyl-Al. However, consistent application and misuse of these chemicals can cause development of fungicide resistant pathogen, destruction of an ozone layer, residue problems of agrichemicals. Therefore, as an alternative for these control measures, biological control with many different types of microorganisms has been regarded as an attractive, environmental-sound alternative for plant disease control. In addition, consumers prefer environmental friendly vegetables and concerns and demands on environmentally friendly biocontol agents have been increased. Therefore we will produce a higher value added in agriculture and environmentally friendly growing procedures through development of biocontrol agents using antagonistic rhizobacteria against Phytophthora blight of pepper.
    In this study, we isolated 439 rhizobacterial strains from soil of cucumber, pepper and tomato of 12 regions of Korea from 2001 to 2003. Out of 439 bacterial strains, 16 potentially antagonistic strains were screened through radicle and seedling assays and in planta trials, and five candidate strains, CCR04, CCR80, GSE09, ISE13, and ISE14, were selected for field tests. we conducted a sequential screening procedure to select antagonistic rhizobacteria against Phytophthora capsici and evaluated control efficacy of drench or root-dip treatments with the selected strains against Phytophthora blight of pepper in the field. In 2005 and 2006 tests, the control efficacy of the five strains was examined against Phytophthora blight of pepper plants drenched with the bacterial suspension in artificial pathogen inoculation. Three strains, CCR04, CCR80, and ISE14, consistently reduced the disease in both tests. As another form of application, the control efficacy of root-dip treatment was examined on pepper plants just prior to transplanting in the field with natural inoculation in 2006 and 2007. In these tests, four strains, CCR04, CCR80, GSE09, and ISE14, showed consistently good control efficacy against P. capsici, and strains CCR80 and ISE14 increased pepper fruit yield. The strain-treated roots had less infection rates by P. capsici compared with control roots regardless of drench or root-dip treatments. In addition, the strains did not affect the populations of bacteria and fungi in the rhizosphere soil. Therefore, the antagonistic strains selected from the screening procedure provided significant protection against P. capsici through pepper root colonization. These strains could be applied by either drench or root-dip treatment as alternatives to agricultural chemicals to control Phytophthora blight of pepper. We identified previously selected antagonistic bacteria KJ1R5 as Chryseboacterium sp., KJ9C8 as Chryseobacterium wanjuense, KJ2C12 as Bacillus luciferensis and CCR04 and CCR80 as Pseudomonas corrugata, GSE09 as Flavobacterium sp., ISE13 as Lysobacter enzymogenes, and ISE14 as Chryseobacterium indologenes. For estimation of disease suppressive mechanisms of antagonistic rhizobacteria, production of antibiotics, extracelluar enzyme, biofilm, HCN, siderophore and root colonization and competition by the selected antagonistic rhizobacteria were tested. Strian ISE13 produce antabiotics and extracellular enzyme such as proteinase and chitinase, and strain CCR04 and CCR80 have biofilm production, swarming ability and effective root colonization ability. Strain GSE09, ISE13, ISE14 also have root colonization ability compared to E. coli as control strain. Therefore, the selected antagonistic rhizobateria will effectively colonize on pepper roots and protect infection courts against Phytophthora capsici and have biocontrol effects.
    For the development of biological control agents to Phytophthora blight, culture characteristic analysis, formulation, industrial fermentation and field test were conducted with Chryseobacterium sp. ISE14. Strain ISE14 was maintained of 7.5×108 cfu(colony forming unit)/㎖ after ten times of subculture. 1% glucose as a carbon source and 2% yeast extract as a nitrate source were selected to optimized culture condition. Strain ISE14 was cultured on 5L jar fermentor in selected medium for 24hr at 30℃ (600rpm, 1vvm). This culture broth has 2×109cfu/㎖ of survival colony unit. Twice glucose feeding were conducted during the strain ISE14 culture on 50L jar fermentor. From the fermentation test, cultured broth's OD (optical density) was increased from 21.8 to 37.0, but maximum survival colony units were not increased. Solid type was selected as strain ISE14 technical type because this type have advantage of colony survival compared with liquid type.
    Survival colony units of freeze-dryed solid technical powder in strain ISE14 was 8×109cfu/g. This technical powder was examined in wettable powder, granule, water dispersible granule and suspension concentrate formulation. Through the aging test of each formulation, wettable powder was selected. After it was examined to change inerts and surfactants, diatomaceous earth as inert and anion surfactant PX as surfactant were selected. CFU at 50℃ was maintained 5.2×104cfu/g during 7days and 2.8×105cfu/g during 14days in wettable powder formulation, but cfu was decreased after 14days. Survival cfu at room temperature was maintained 6.7×106cfu/g during 7days, 2.8×105cfu/g during 14days and 9-5.6×103cfu/g during 56days.
    Technique and formulation of strain ISE14 were examined to acute oral toxicity, acute dermal toxicity and fish toxicity. As a results, each lethal dose 50 (LD50) of acute oral toxicity and acute dermal toxicity were over 5,000mg/kg. In case of fish toxicity, lethal concentration (LC50,48hrs) was over 10ppm, these results not have any problem of toxicity.
    Through the fermentation of strain ISE14, 2.7×108cfu/g of technical was produced by using five ton industrial fermenter and freeze dryer and then 30% wettable powder was produced after mixed with co-fomulants. Efficacies of strain ISE14 technical against Phytophthora blight in greenhouse and small scale field were 51.3 and 49.0%, respectively. Strain ISE14 formulation was tested in pepper field of prevalent Phytophthora blight (Uiseong in Korea), but efficacies were low being 36.4% at 8 days after last treatment and 16.5% at 29 days after last treatment, respectively.


    본 연구는 내생·근권세균을 이용한 환경친화적 고추역병 억제용 미생물 살균제 개발을 위하여, 선발된 내생·근권세균(CCR04, CCR80, GSE09, ISE13, ISE14)의 고추 역병에 대한 포장검정을 수행하였다. 포장실험에서 ...

    본 연구는 내생·근권세균을 이용한 환경친화적 고추역병 억제용 미생물 살균제 개발을 위하여, 선발된 내생·근권세균(CCR04, CCR80, GSE09, ISE13, ISE14)의 고추 역병에 대한 포장검정을 수행하였다. 포장실험에서 내생·근권세균의 병방제효과 기준 설정 및 방제가 결정을 하였고, 상용 농약과의 내생·근권세균 역병 방제 효과 능력 비교 검정하였다. 선발된 내생·근권 세균과 길항미생물의 생리, 분자생물학적 분류, 동정를 위하여, 16S rDNA 염기서열 분석, Biolog system, FAMEs analysis, TEM 과 SEM을 통한 morphological analysis, 생리, 생화학적 방법을 통한 분류를 하였으며, 선발된 내생·근권 세균의 고추병에 대한 병 억제 작용 기작 연구를 위하여, 선발 내생·근권세균이 처리된 토양에서 미생물상, 총 진균 및 세균의 미생물상을 조사하였고, fluorescent diacetate analysis에 의한 토양 미생물 및 내생·근권세균의 활성 평가를 하였다. 또한 선발 내생·근권세균의 spontaneous rifampicin - resistance mutant 제조하여 이를 이용한 식물체 근권정착력을 조사하였고, 선발 내생·근권세균이 분비 하는 효소 및 siderophore, HCN, antibiotics 생성에 의한 병억제 기작을 연구하였다. 내생·근권 세균을 처리한 고추에서 길항세균의 식물근권 정착 능력을 연구하기 위하여, 고추 근권에 내생·근권세균 처리 후 시간 별로 뿌리를 채취하여 근권에서의 미생물 상 조사하였으며, 채취한 뿌리 조직에서 현미경을 이용한 식물 근권에서 선발 내생·근권세균의 존재 형태를 관찰하였다. 탄소원 첨가에 의한 생물학적 방제 효과의 증진 연구를 위하여, 선발된 내생·근권세균의 생물적 방제 효과 증진을 위한 연구를 수행하였으며, 생물학적 방제 균주에 의해서만 잘 이용되는 탄소원 선발하여 방제 효과 증진에 관하여 연구하였다.
    이러한 내생·근권세균의 상용화를 위하여, 균주의 기초배양연구를 수행하여 선발된 균주가 반복적인 계대배양을 통해 고유한 특성이 불활성화 되지 않는 여부를 검정하여 산업용 균주로 사용될 수 있는 안정성을 확보하였으며, 길항미생물 시험용원제를 확보하였다. 확보된 길항미생물 시험용원제를 대량배양하기 위한 최적화된 배양법을 확립하였으며, 생물농약 등록에 만족하는 제형화기술을 개발하였다. 이를 위하여 미생물농약이 요구하는 생존하고 있는 유효미생물의 밀도를 일정수준으로 유지시켜 주는 제형화기술을 개발하였으며, 각각의 균주의 특성에 따른 제품의 경제성을 확보하기 위한 최소한의 실용성 기준을 설정하고 이 규격에 맞는 제형을 개발하였다. 이렇게 개발된 원제를 생물농약 등록을 위한 원제독성시험을 수행하였으며, 대량배양을 통한 시제품을 상업화에 필요한 약효 및 경제성을 확보할 수 있도록 제작하였다. 이러한 시제품에 대한 독성평가를 수행하여 상업화 가능성을 확인하였으며, 생산된 시제품이 등록시험의 요건을 만족하는지에 대한 포장시험을 수행하여 상업화 가능성을 평가하였다.


  • 목차(Contents) 

    1. 제출문 ... 1
    2. 요약문 ... 3
    3. SUMMARY ... 9
    4. CONTENTS ... 13
    5. 목차 ... 17
    6. 제1장 연구개발과제의 개요 ... 21
    7. 제1절 연구개발의 목적 ... 21
    8. 제2절 연구개발의 필요성 ... 22...
    1. 제출문 ... 1
    2. 요약문 ... 3
    3. SUMMARY ... 9
    4. CONTENTS ... 13
    5. 목차 ... 17
    6. 제1장 연구개발과제의 개요 ... 21
    7. 제1절 연구개발의 목적 ... 21
    8. 제2절 연구개발의 필요성 ... 22
    9. 제3절 연구개발의 범위 ... 27
    10. 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 30
    11. 제1절 국내·외 관련기술의 현황과 문제점 ... 30
    12. 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 39
    13. 1절 연구개발수행 내용 ... 39
    14. 2절 연구개발수행 결과 ... 56
    15. 1. 기선발된 내생.근권세균의 고추 역병에 대한 길항 효과 및 포장 검정 ... 56
    16. 가. 길항 근권 세균의 수집 ... 56
    17. 나. 길항 세균의 순차적 선발 (유근 검정) ... 57
    18. 다. 길항 세균의 순차적 선발 (유묘 검정) ... 59
    19. 라. 길항 세균의 순차적 선발 (성체식물 검정) ... 59
    20. 마. 길항 세균의 포장 검증 ... 61
    21. 2. 선발된 내생.근권세균과 길항 미생물의 생리, 분자생물학적 분류 및 동정 ... 78
    22. 가. 16S rDNA sequence 분석을 통한 동정 ... 78
    23. 나. 고추 역병에 대한 내생근권 길항 세균의 투과전자현미경 관찰 ... 85
    24. 다. Biolog 분석 ... 87
    25. 라. Fatty acid methyl ester (FAME) analysis를 통한 동정 ... 88
    26. 마. 생리생화학적 특성에 의한 동정 ... 92
    27. 3. 선발된 내생.근권 세균의 고추병에 대한 병억제 작용 기작 연구 ... 98
    28. 가. 항생 물질 분비 ... 98
    29. 나. 세포외 효소 분비 ... 103
    30. 다. Biofilm 형성 ... 106
    31. 라. HCN 형성 ... 107
    32. 마. Siderophore 형성 ... 108
    33. 바. Swarming ability ... 109
    34. 사. 근권 세균에 의한 식물호르몬 IAA의 생성 ... 110
    35. 4. 내생.근권세균을 처리한 고추에서 길항 세균의 식물근권 정착 능력 연구 ... 111
    36. 5. 내생.근권세균의 고추역병균과의 경쟁에 대한 연구 ... 113
    37. 6. 탄소원 첨가에 의한 생물학적 방제 효과의 증진 연구 ... 114
    38. 가. ISE14의 탄소원 이용도 조사 ... 114
    39. 나. 탄소원 첨가에 의한 생물적 방제균 KJ1R5의 고추 역병 방 ... 118
    40. 다. 여러 탄소원의 추가에 의한 KJ1R5의 P. capsici에 의한 고추 역병 방제 효과 증진 ... 120
    41. 협동과제: 생물적 방제용 미생물제제의 상업화 연구 ... 123
    42. 1. 선발된 균주에 대한 기초배양연구 및 시험용 원제 확보 ... 123
    43. 가. 생산균주의 순계 확인 및 안정화 ... 123
    44. 나. 선발 균주의 type culture를 통한 배양 양상 구명 ... 124
    45. 2. Pilot scale 배양 수행 및 배양액의 원제형태 결정 ... 125
    46. 가. 기존배지를 출발점으로 생물적 방제를 위한 최적 조건으로 배양법 확립 ... 125
    47. 나. 대량배양 공정개발을 위한 예비시험 ... 133
    48. 3. 생물농약 등록에 만족하는 제형화 개발 ... 139
    49. 가. 기본 제형 연구 ... 139
    50. 나. 제형개발 및 처방개선 검토 ... 143
    51. 다. 약효증진용 부자재 탐색 ... 144
    52. 라. 계면활성제의 종류에 따른 안정적인 제형개발 ... 145
    53. 마. 포장시험 및 제조허가용 시제품 제조 ... 148
    54. 4. 생물농약 원제 및 제품에 대한 독성시험 ... 148
    55. 가. ISE14원제의 마우스를 이용한 단회 투여 경구독성시험 ... 148
    56. 나. ISE14 원제의 랫드를 이용한 단회 투여 경피독성시험 ... 152
    57. 다. ISE14 원제의 잉어를 이용한 단회 투여 급성독성시험 ... 156
    58. 라. ISE14 30% 수화제의 마우스를 이용한 단회 투여 경구독성시험 ... 159
    59. 마. ISE14 30% 수화제의 랫드를 이용한 단회 투여 경피독성시험 ... 162
    60. 바. ISE14 30% 수화제의 잉어를 이용한 단회 투여 급성 독성시험 ... 166
    61. 5. 대량생산을 통한 시제품 제작 ... 170
    62. 가. ISE14 균주의 대량배양 ... 170
    63. 나. 시제품제작 ... 170
    64. 6. 생물약효시험 및 포장시험 ... 170
    65. 가. in vivo 시험에서 기본제제의 활성 검정 ... 170
    66. 나. 소포장실험을 통한 기본제제의 활성 검정 ... 171
    67. 다. 포장시험에서 시제품의 활성 검정 ... 173
    68. 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 175
    69. 제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 181
    70. 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 185
    71. 제7장 참고문헌 ... 190
  • 참고문헌

    1. 전체(0)
    2. 논문(0)
    3. 특허(0)
    4. 보고서(0)

 활용도 분석

  • 상세보기

    amChart 영역
  • 원문보기

    amChart 영역