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보고서 상세정보

유전체 해석을 통한 S. lividans 세포 재설계 및 아미노글리코사이드 생산 공정 개발
Genome analysis, redesign of S. lividans and process development for the production of aminoglycosides

  • 사업명

    21세기프론티어연구개발사업

  • 과제명

    유전체 해석을 통한 S. lividans 세포 재설계 및 아미노글리코사이드 생산 공정 개발

  • 주관연구기관

    한국과학기술원
    Korea Advanced Institute of Science and Technology

  • 연구책임자

    장용근

  • 참여연구자

    홍순광   김창준   김현한   송재양   문명희   조만교   조성준   문안나   김재형   정용훈   김정훈   ...  

  • 보고서유형

    최종보고서

  • 발행국가

    대한민국

  • 언어

    한국어

  • 발행년월

    2008-06

  • 과제시작년도

    2007

  • 주관부처

    과학기술부

  • 사업 관리 기관

    한국과학재단
    Korea Science and Engineering Foundtion

  • 등록번호

    TRKO201000011986

  • 과제고유번호

    1355049327

  • DB 구축일자

    2013-04-18

  • 초록 


    The major objective is to develop new processes for maximal production of aminoglycoside-family secondary metabolites by genome a...

    The major objective is to develop new processes for maximal production of aminoglycoside-family secondary metabolites by genome analysis and thereby redesign of S. lividans. Our model compound, valiolamine is the starting material for the production of voglibose which is a diabetes drug with a very large market. A one-stage fermentation process for valiolamine production is to be developed.
    Ⅲ. Methods and Research Contents
    In the first step we investigated the gene cluster of validamycin and salbstatin biosynthesis to develop the recombinant strain for valiolamine biosynthesis. Four recombinant vectors containing the gene cassettes for the synthesis of valiolamine were constructed, and transformed into Streptomyces albus. Four transformants were cultivated for 10 days, and the culture broth was analyzed by thin layer chromatography (TLC) and bioassay.


    발리올아민 생산 균주 개발을 위하여 먼저 발리다마이신 및 살보스타틴 생합성 유전자군의 기능을 규명하였다. 이중 발리올아민 생합성에 필요할 것으로 예상되는 단편들(각각 12, 14, 15, 17kb)을 클로닝하고 재조합 벡터를 제작하...

    발리올아민 생산 균주 개발을 위하여 먼저 발리다마이신 및 살보스타틴 생합성 유전자군의 기능을 규명하였다. 이중 발리올아민 생합성에 필요할 것으로 예상되는 단편들(각각 12, 14, 15, 17kb)을 클로닝하고 재조합 벡터를 제작하여 treptomyces albus에 도입하였다. 네 가지 형질전환 균주를 배양하여 TLC 분석 및 bioassy를 통하여 발리올아민 생산 여부를 확인하였다.
    형질전환체의 배양액 내 생성물 분석에 앞서 Fangye Industry에 위탁하여 발리올아민 표준품을 합성하고 Mass와 NMR 분석으로 순도를 확인하였다. 표준품을 이용하여 TLC, HPLC 분석 조건 및 bioassay 분석법을 확립하였다. 또한 배양액 내 발리올아민의 분리정제 및 분석의 전처리 목적으로 양이온교 환수지, 흡착 pH, 용리 조건등을 최적화 하였다.
    여러 배지 조건과 배양 기간을 테스트하여 재조합 균주의 생장 특성 및 안정성, 발리올아민 생산량을 조사하였다. 방선균 배양에서 널리 쓰이는 복합배지들을 선정하여 기초배양 실험을 수행한 결과 살보스타틴 생합성 유전자가 도입된 균주들이 더 유용하다고 판단하였다. 아미노글리코사이드계 물질의 생산을 높이는 총 다섯 가지의 배지에 두 재조합균주를 배양하여 최적배지를 선정하고자 하였다. 플라스크 배양을 수행하고 6, 10일 째의 배양액을 위하여 전처리를 거친 후 TLC 및 HPLC로 분석하였다.
    방선균에서의 이차대사산물 생산성 향상 기초 연구로서 외래 헤모글로빈 유전자인 VHB와 SM을 S. lividans에서 발현 시켜 actinorhodin의 생산량 증진을 확인하고, RT-PCR을 이용하여 조절 유전자들의 발현 변화를 분석하였다.또한 S. lividans와 가장 유사한 S. coelicolor에 pH shock을 도입하여 그 효과를 분석하였다. 중성 pH 조건에서 고체 배양 2일 후 pH 4의 배지로 옮겨 acidic pH shock을 가해준 경우 actinorhodin의 양이 10배 이상 증진 되었으며, 반응기에서 65시간 배양 후 3시간동안 pH 4로 강하하는 실험을 수행한 경우 actinorhodin의 분비가 증진되는 것을 확인하였다. 고체 배양에서 pH
    shock을 가해준 cell에서 단백질을 취하여 전기영동을 통한 proteome 분석 및 질량분석을 수행하고 RNA를 추출하여 transcriptional level의 분석을 수행하여 발현량을 관찰하였다.
    유전체 재설계 S. lividans 제작 및 유전자 발현 최적화 연구의 기반으로, 자료 및 문헌조사를 통하여 이차대사의 생합성 환원력을 부여하는 NADPH의 중요성과 그 생산에 관여하는 5탄당 인산회로 (PPP) 관련유전자의 존재를 확인하였다. 관련 유전자들을 cloning하여 PPP강화 S. lividans를 제작하고 여러 형질전환체의 NADPH 농도를 HPLC로 분석하여 PPP 대사의 활성화를 확인하였다. 필요하지 않은 대사경로를 제거하여 원하는 물질의 생산에 최적화된 균주를 만들기 위해 S. lividans choromosomal DNA로부터 actinorhodin 생합성 유전자 클러스터를 제거한 변이주를 제작하였다.
    한편 살보스타틴 유전자군 분석 중 트레할로스 생합성에 필요한 유전자를 발견하여 추가 연구를 수행하였다. 관련 유전자 5개를 클로닝하여 이들 유전자를 포함하는 벡터를 제작하고, 이를 S. lividans에 도입하여 트레할로스 생산을 확인하였다. 트레할로스 정량 분석을 위해 여러 컬럼 및 HPLC 분석 조건 등을 테스트하여 최적 분석법을 확립하였다. 트레할로스 생산성 향상을 위해 통계학적 최적화 방법인 Plackett-Burman 실험계획법을 이용하여 positive effect를 보이는 배지 성분을 선별하고 이를 통한 최적화 연구를 수행하였다. 마지막으로 실제 생산에서 사용 될 발효조 배양에서의 생산 특성을 파악하기 위하여
    여러 배지 조건에서의 비교, 회분식 및 유가식 배양 비교, pH 조절 조건의 비교 연구를 수행하였다.


  • 목차(Contents) 

    1. 제출문...1
    2. 요약문...2
    3. SUMMARY...6
    4. CONTENTS...11
    5. 목차...13
    6. 제1장 연구개발과제의 개요 ...15
    7. 제2장 국내외 기술개발 현황 ...18
    8. 제1절 방선균 산업 균주 개발 현황 ...18
    9. 제2절 발리올아민 관련 기술...
    1. 제출문...1
    2. 요약문...2
    3. SUMMARY...6
    4. CONTENTS...11
    5. 목차...13
    6. 제1장 연구개발과제의 개요 ...15
    7. 제2장 국내외 기술개발 현황 ...18
    8. 제1절 방선균 산업 균주 개발 현황 ...18
    9. 제2절 발리올아민 관련 기술 현황 ...18
    10. 제3절 트레할로스 생산 기술 현황 ...19
    11. 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ...20
    12. 제1절 연구수행 방법 및 내용 ...20
    13. 1. 발리올아민 생산 균주 개발 ...20
    14. 2. 발리올아민 분석 및 분리정제 방법 개발 ...22
    15. 3. 발리올아민 생산성 향상 연구 ...28
    16. 4. 헤모글로빈 유전자 도입 및 pH shock 이용 공정 기술 개발 ...28
    17. 5. 유전체 재설계 S. lividans 제작 및 유전자 발현 최적화 연구 ...31
    18. 6. 트레할로스 생산 공정 개발 ...33
    19. 제2절 연구개발 결과 ...39
    20. 1. 발리올아민 생산 균주 개발 ...39
    21. 2. 발리올아민 분석 및 분리정제 방법 개발 ...59
    22. 3. 발리올아민 생산성 향상 연구 ...65
    23. 4. 헤모글로빈 유전자 도입 및 pH shock 이용 공정 기술 개발 ...73
    24. 5. 유전체 재설계 S. lividans 제작 및 유전자 발현 최적화 연구 ...87
    25. 6. 트레할로스 생산 공정 개발 ...93
    26. 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ...103
    27. 제1절 연차별 연구 개발 목표, 내용, 결과 및 달성도 ...103
    28. 제2절 본 연구의 질적 우수성 및 관련 분야 기여도 ...104
    29. 제5장 연구개발결과의 활용계획 ...105
    30. 제1절 연구 개발 성과의 응용 잠재력 및 사업화 가능성 ...105
    31. 1. 기술적 응용잠재력 ...105
    32. 2. 사업화로서의 활용가능성 ...105
    33. 제2절 연구 개발 성과의 파급 효과 ...106
    34. 1. 산업 분야 ...106
    35. 2. 공공 분야 ...106
    36. 제3절 응용 연구 및 사업화 계획 ...107
    37. 1. 응용 연구 ...107
    38. 2. 사업화 계획 ...107
    39. 제6장 참고문헌 ...108
  • 참고문헌

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