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보고서 상세정보

초내열성 탄수화물 효소의 개발 및 이용
Investigation and applications of hyperthermostable carbohydrate enzymes

  • 사업명

    21C 프론티어연구개발사업

  • 과제명

    초내열성 탄수화물 효소의 개발 및 이용

  • 주관연구기관

    서울대학교
    Seoul National University

  • 연구책임자

    박관화

  • 참여연구자

    이명희   변성배   노선아   방정자   신민기   신성철  

  • 보고서유형

    최종보고서

  • 발행국가

    대한민국

  • 언어

    한국어

  • 발행년월

    2005-05

  • 과제시작년도

    2002

  • 주관부처

    과학기술부

  • 사업 관리 기관

    한국과학재단
    Korea Science and Engineering Foundtion

  • 등록번호

    TRKO201000012003

  • 과제고유번호

    1350014090

  • DB 구축일자

    2013-04-18

  • 초록 


    The discovery of thermophilic microorganisms has been one of the majorevents of the past 10 years, with their carbohydrate enzyme...

    The discovery of thermophilic microorganisms has been one of the majorevents of the past 10 years, with their carbohydrate enzymes being of specialinterest. Enzymes used today in starch processing have temperature and pH requirements that vary depending on their thermostability and physicochemical properties. Performing starch liquefaction and saccharification in conditions of high temperature and neutral pH would be highly desirable in order to decrease the cost of glucose production. Therefore, the development of extremely thermostable carbohydrate enzymes that are active at high temperature and at neutral pH would highly benefit the starch-processing industry. The aim of this study is to investigate the hyperthermophilic carbohydrate enzymes from extremophiles and their applications in bioindustry. The starch conversion process could be improved by finding efficient and extremely thermostable carbohydrate enzymes that act at high temperatures and neutral pH in both the liquefaction and saccharification steps. Carbohydrate enzymes from hyperthermophiles such as Thermotoga and Sulfolobus strains can be used to improve starch conversion processing. To obtain suitable amounts of enzyme protein, the genes encoding various carbohydrate enzymes were cloned and expressed and the enzyme protein purified. The activity of recombinant enzymes were compared to those of mesophilic carbohydrate enzymes usually used in the multisteps of starch processing. These enzymes are interesting not only because of their biotechnological potentialities, but also because they can be used as models to study mechanisms of hyperthermophilicity.


    탄수화물은 주로 전분의 형태로 식물체에 존재하며 에너지원으로 자연계에 존재하는 풍부한 천연자원 중의 하나이며 대부분의 동물과 사람은 전분으로부터 생명활동에 필요한 기초적인 에너지를 얻고 있다. 전분은 단당류인 포도당으로 이루어진거대...

    탄수화물은 주로 전분의 형태로 식물체에 존재하며 에너지원으로 자연계에 존재하는 풍부한 천연자원 중의 하나이며 대부분의 동물과 사람은 전분으로부터 생명활동에 필요한 기초적인 에너지를 얻고 있다. 전분은 단당류인 포도당으로 이루어진거대분자이며 단위체인 포도당이 α-1,4 혹은 α-1,6 당결합으로 연결되어 있다. 전분이 섭취되어 체내로 유입되면소화기관에 분포되어 있는 α-amylase, α-glucosidase와 같은 전분가수분해효소에 의하여 단위체인 포도당으로 가수분해된 후 체내로 흡수되며 신체활동의 주요 에너지원으로 이용되고 있다. 이렇듯 포도당은 영양 생리상 가장 중요한 당이며 식품산업에서도 중요한 식품소재로 널리 이용되고 있으며 또한, 피혁제품, 화장품, 의약품 등에 이용되는 등 그 응용범위가 상당히 광범위하다.
    전분으로부터 포도당을 제조하는 방법은 산가수분해법과 효소분해법이 있으나 현재는 대부분 효소분해법을 이용하여 포도당을 생산하고 있으며 산가수분해법과 비교하면 1) 부산물생성이 10배 이상 감소하고, 2) 회분의 생성량이 절반정도로 적으며, 3) 착색이 적어 정제 가 용이하고, 4) 낮은 품질의 전분을 사용할 수 있어 비용절감이 되며, 5) 에너지가 적게 소 모되는 등 여러 가지 장점을 가지고 있다. 현재까지 사용되어 온 효소분해법을 이용한 포도 당의 제법은 우선 전분을 호화시킨 후 α-amylase를 첨가하여 액화시키고 이 전분 액화액 에 glucoamylase를 처리하여 포도당을 생성시킨 후 여러 가지 방법으로 결정화하여 무수결 정, 함수결정, 정제포도당을 얻게 된다. 즉, 30% 전분 slurry (pH 4.2)에 NaOH를 첨가하 여 pH를 6.0~6.2로 조절하고 내열성 α-amylase를 가한 후, 105℃의 jet cooker를 통과 시켜 약 5~10 분 동안 호화시킨 후, 95℃에서 1~2시간 반응하여 액화를 완료시킨다. HCl 을 가하여 용액의 pH를 다시 4.2~4.5로 조절한 후, pullulanase와 당화 효소인 glucoamylase를 첨가하여 58℃에서 72시간 동안 반응시켜 포도당을 제조한다. 그러나, 이 공정에서는 산, 알칼리를 반복 사용하여 불순물인 염이 생산되고, 각 효소의 최적 온도가 다르므로 반응액을 냉각시켜야 하며, 이 때 낮은 온도에서 반응하게 되어 미생물의 오염 위험 이 따를 뿐만 아니라 72시간 이상의 긴 시간이 소요되므로 생산효율이 낮아지게 된다. 따라 서, 높은 온도에서 pH 조절없이 일정하게 하여 당화반응을 진행시킬 수 있는 내열성 효소를 사용할 경우 반응온도를 고온인 80~90℃로 유지하면서 단시간에 제조할 수 있어 미생물오 염을 없애며, 제조공정시간을 대폭 감소시킬 수 있는 장점이 있다.
    최근에는 생명체가 전혀 서식하기 어렵다고 생각되는 극한 환경에 적응하여 서식하는 미 생물이 분리되어 보고되고 있다. 이러한 미생물들을 극한 미생물이라 하며, 극한 미생물은 진화의 긴 과정에서 엄밀한 극한 환경에 적응하여 생존능력을 획득하였다고 추측하고 있다. 극한 미생물은 지구상의 통상적인 일반 환경에 서식하는 일반 미생물과 기본적으로 같은 생 육방식을 취하고 있는 데, 유전적 정보는 DNA의 염기 배열로 결정되며, 단백질은 아미노산 으로부터 만들어지고, 세포는 지질막으로 외계로부터 구분되어져 있다. 그러나 극한 환경이 라고 불리워지는 엄밀한 환경에 적응하며 생육하기 위해 극한미생물의 대사 체계는 일반적 인 미생물과는 크게 다르고 대사활동을 담당하는 효소의 특성 역시 기존의 효소와는 큰 차 이를 보이고 있어 극한 미생물의 기능 및 관련 기술에 대한 연구는 신규 미생물 자원의 탐 색 및 확보에 중요한 기술로 인식되고 있다. 극한 미생물 중에서도 가장 연구가 잘 되어 있 는 초고온성 미생물(hyperthermophile)이 보유한 내열성 효소는 일반적 생명체가 견디기 어려운 고온에서 (80℃ 이상)에서 안정하기 때문에 현재 효소를 이용한 공정개발에 문제가 되는 enzyme thermostability와 thermoactivity에 대한 관심으로 다른 극한 효소에 비해 많은 연구가 진행 중에 있다. 이러한 초고온성 미생물에 존재하는 탄수화물 효소 역시 높은 내열성을 가지고 있고 그 작용특성이 다양하므로 이를 규명하는 연구가 많이 이루어지고 있다.
    최근에는 초고온성 미생물에서 유래한 효소를 산업적으로 이용하고자하는 시도가 많아지고 있다. 또한, genome project에 의하여 미생물 유전자의 전체 염기서열을 확보한 후 유용 효소를 탐색하는 방법이 많이 사용되고 있으므로 본 연구에서는 초고온성 미생물로부터 유 용한 내열성 효소를 탐색, 확보한 후 전분으로부터 포도당 생산 공정에 효율적으로 이용할 수 있도록 효소를 개량하는 연구를 수행하였고, 포도당 생산 공정을 최적화하여 산업화 가능 성을 타진하였다.
    1년차
    - 초내열성 미생물 효소 유전체 탐색
    BLAST search를 통해 GenBank에 등록된 초고온성 미생물의 유전체 분석
    유용한 탄수화물 효소로 추정되는 유전자 후보군 설정
    - 초내열성 미생물 효소 유전체의 확보
    미생물 보관 기관에서 초고온성 미생물 분양, 균주 확보
    초고온성 미생물 배양, 유전체 분리
    - 기확보된 초고온성 미생물로부터의 탄수화물 효소 유전자 분리
    Thermotoga maritima와 Sulfolobus sulfataricus의 유전체 분석
    탄수화물 효소로 추정되는 유전자 클로닝
    2년차
    - 초고온성 미생물 유전체로부터 탄수화물 효소 유전자의 분리
    초고온성 미생물 유전체 염기서열 정보에 의거한 프라이머 설계
    Polymerase Chain Reaction을 이용한 유전자 클로닝
    - 초고온성 미생물 유전체 산물의 생산
    대장균에서의 효소 생산
    대장균용 대량 생산 vector를 이용한 발현
    폴리히스티딘, 말토스 결합 단백질 등의 태깅을 통해 융합단백질 제조
    이온교환 크로마토그래피를 통한 고수율 정제법 확립
    - 미생물 유전체의 기능 해석
    효소의 반응 메카니즘 규명을 통한 효소의 기능 해석
    3년차
    - 초고온성 미생물 유전체 산물의 생산
    - 산업적 응용
    생화학적 특성이 규명된 신규 탄수화물 효소의 산업적 이용 가능성 타진
    전분제조공정의 개선
    1) 단일 공정화
    2) 제조공정 최적화
    1단계(종합)
    - 초내열성 미생물 효소 유전체 탐색
    - 초고온성 미생물 효소의 특성 규명
    - 초고온성 미생물 유전체 산물의 생산
    - 산업적 응용 (포도당 제조 공정의 최적화)


  • 목차(Contents) 

    1. 표지...1
    2. 제출문...2
    3. 요약문...3
    4. SUMMARY...8
    5. CONTENTS...9
    6. 목차...10
    7. 제1장 연구개발과제의 개요...11
    8. 1. 연구개발의 필요성...11
    9. 제2장 국내외 기술개발 현황 ...16
    10. 제3장 연구개발수행 ...
    1. 표지...1
    2. 제출문...2
    3. 요약문...3
    4. SUMMARY...8
    5. CONTENTS...9
    6. 목차...10
    7. 제1장 연구개발과제의 개요...11
    8. 1. 연구개발의 필요성...11
    9. 제2장 국내외 기술개발 현황 ...16
    10. 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ...17
    11. 1. Sulfolobus solfataricus에서 glucoamylase의 발현 및 당 제조 공정 연구...17
    12. 2. Sulfolobus tokodaii 에서 glucoamylase의 발현 및 당 제조 공정 연구...19
    13. 3. Pyrococcus furiosus DSM3638에서 maltogenic amylase의 발현 및 특성 연구...21
    14. 4. Pyrococcus furiosus DSM3638에서 cyclodextrin glucanotransferase의 발현 및 특성 연구...23
    15. 5. Thermus scotoductus 에서 α-glucanotransferase의 발현 및 특성 연구...25
    16. 6. Sulfolobus solfataricus P2에서 Glycogen Debranching Enzyme의 발현 및 특성 연구...26
    17. 7. Thermoplasma volcanium에서 maltogenic amylase의 발현 및 특성 연구...28
    18. 8. Thermus sp. maltogenic amylase의 site-direct mutagenesis를 이용한 내열성...30
    19. 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ...32
    20. 1. 연차별 연구 내용 및 범위...32
    21. 2. 연구개발성과...33
    22. 3. 연구개발성과의 질적 우수성...33
    23. 제5장 연구개발결과의 활용계획 ...34
    24. 1. 학술적 활용...34
    25. 2. 산업적 활용...34
    26. 3. 산업적 활용을 위한 추가 연구...34
    27. 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ...35
    28. 제7장 참고문헌 ...36
  • 참고문헌

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