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보고서 상세정보

TDP-aminodeoxysugar 생산 및 신규 반코바이신의 합성

  • 사업명

    21C프론티어연구개발사업

  • 과제명

    TDP-aminodeoxysugar 생산 및 신규 반코마이신의 합성

  • 주관연구기관

    진켐(주)

  • 연구책임자

    우진석

  • 참여연구자

    정영수   김대희   강선엽  

  • 보고서유형

    최종보고서

  • 발행국가

    대한민국

  • 언어

    한국어

  • 발행년월

    2005-07

  • 과제시작년도

    2003

  • 주관부처

    과학기술부

  • 사업 관리 기관

    한국과학재단
    Korea Science and Engineering Foundtion

  • 등록번호

    TRKO201000012032

  • 과제고유번호

    1350000757

  • DB 구축일자

    2013-04-18

  • 초록 


    The basic concept of the research includes reconstructing of biosynthetic genes of deoxysugar and aminodeoxysugar on plasmid and ...

    The basic concept of the research includes reconstructing of biosynthetic genes of deoxysugar and aminodeoxysugar on plasmid and chromosome, setting up biosynthetic pathway of various sugar moieties, and production of various deoxysugars and aminodeoxysugars in vivo and in vitro. The establishment of synthetic method for the new improved antibiotic materials with various sugar moieties, which has a great affect on the microbiological activity and resistance of vancomycin and macrolide glycone, by the transformation of sugar-producing plasmids is also included.
    The purpose is the reconstructions of biosynthetic gene cluster and the study of biosynthetic pathway in order to synthesize several TDP-deoxysugars and TDP-aminodeoxysugars (desosamine, duanosamine and vancosamine) and finally to produce new vancomycin and macrolide derivatives replaced by deoxysugar and aminodeoxysugar from the strain transformed the reconstructed plasmids in vivo and in vitro.


    1년차
    ○Desosamine 생합성 유전자를 확보하기 위해 S. venezuery의 제작 및 클론에 의해 Desosamine 생합성 유전자가 포함된 pSVD10을 확보. Des 유전자 집단을 pIBR100에 재조합하여 pDES...

    1년차
    ○Desosamine 생합성 유전자를 확보하기 위해 S. venezuery의 제작 및 클론에 의해 Desosamine 생합성 유전자가 포함된 pSVD10을 확보. Des 유전자 집단을 pIBR100에 재조합하여 pDES100을 제작.
    ○ in vitro에서 TDP-4-keto-6-deoxyglucose를 대량생산하여 판매를 하고 있으며, 그 다음 생합성은 3-4단계로 이루어져있다. 현재 해당되는 생합성 유전자들을 발현벡터에 클론하였으며, 몇 효소들은 발현하여 활성을 확인. 활성이 확인된 효소를 이용하여 TDP-L-rhmanose를 합성 및 확인.
    ○TDP-3,4-diketo-2,6-dideoxyglucose 의 합성에 관계된 TDP-glucose 2,3-dehydratase를 클론하여 발현하였으며, 반응성을 NMR과 Mass를 통해서 확인.
    ○ 방선균내에서 발현할수 있는 High copy 발현벡터를 만들기 위하여 2개의 act promoter (PactIII/PactI)와 생합성 과정의 특정 조절 유전자(ActII-ORF4)를 사용하였다. 제작된 벡터는 pIBR10, pIBR20, pIBR30, pIBR100 및 pIBR150
    ○ NADH 재사용 시스템에 사용하기위하여 GDH(glucose dehydrogease)효소를 확보하였으며, NAD+에서 NADH로 반응성이 매우 좋음.
    2년차
    ○ 다양한 당 합성을 위한 plasmid 개발
    pYJ135, pYJ136, pYJ140, pYJ142, pYJ144, pYJ146의 제작 및 pRD200, pRLS102, pRLD201의 제작
    ○ in vitro 에서 TDP-D-aminosugar 및 유도체의 생합성 연구 및 합성
    TDP-aminosugar 관련 3개 유전자 발현, TDP-aminosugar 1종 합성, TDP-L-rhamnose의 대량생산, stRmlA (TDP-glucose synthase) 열적안정 효소의 확보
    ○ Deoxysugar 유전자 확보
    Streptomyces spp SCC-2136의 library 제작, amicetose 및 aculose생합성 유전자가 포함된 pSCC1-10 cosmid의 분리, pSCC5의 염기서열 분석으로부터 14개의 ORF의 확보.
    ○ 당치환 모델 macrolide 및 반코마이신의 합성
    Des mutant 균주 (S. venezuelae YJ003) 제작 후 pYJ136 plasmid를 integration 하여 신규 마크로라이드인 D-quinovosyl-methynolide, D-olivosyl-methynolide, D-quinovosyl-pikrolide, D-olivosyl-pikrolide를 합성. Vgt1 및 Vgt2 반응성 조사, hydrolysis에 의해 psedovancomycine의 g 스케일 합성. Vgt2 (vancomycin glycosyltransferase 2)는 vancomycin aglycone에 대한 오로지 TDP-glucose 만 반응하는 기질 특이성을 보여줌, Vgt1는 vnacomycin oseudoaglycone에 TDP-L-rhamnose와 반응하여rhamnosyl-vancomycin 합성
    3년차
    ○ Aminodeoxysugar의 합성 및 생합성 유전자 연구
    발현 및 반응이 확인된 여러 효소(Gerik, GeriF, WecE, Ole6, Ole9, PMM, NovS, NovU, DnrJ, GeriS,GeriQ, SchJ, SchP, SchK)를 이용하여 one-pot reaction에 의한 TDP-aminodeoxysugar 및 유도체의 대량 합성 (1g scale), 분리 정제 system 구축 및 구조분석. TDP-6-deoxy-D-allose, TDP-galactose, TDP-fucosamine, TDP-2-deoxyglucose, TDP-viosamine 의 합성.
    ○ 대량 배양에 의한 신규 macrolide의 분리 및 분석진행.
    D-quinovosyl-methynolide, D-olivosyl-methynolide, D-quinovosyl-pikrolide및D-olivosyl-pikrolide
    ○ in vitro에서 합성된 신규 vancomycin의 분석 진행.
    ○ 이종 숙주로부터 당을 합성할 수 있는 발현시스템 6종.
    ○ S. sp. SCC-2136로부터 trideoxysugar 유전자 확보.
    1단계 (종합)
    ○ 3개의 S. venezuelae mutant 균주를 얻었으면, in vivo에서 4종의 신규 macrolide이 합성. in vitro에서 Aglycone-vancomycin 및 pseudo-vancomycin를 합성하고, VanD and VanE 발현 하여 TDP-L-rhamnose와 반응하여rhamnosyl-vancomycin 합성.
    ○ 여러 효소에 대한 발현 및 반응성을 확인하고 이를 이용하여 one-pot reaction에 의한 6종 이상에 TDP-aminodeoxysugar 및 TDP-deoxysugar의 대량 합성(1g scale), 분리 정제 system 구축 및 구조 분석 확인.
    ○ 다양한 당 합성을 위한 plasmid 9개를 제작하였으며, TDP-aminodeoxysugar에 관여하는 유전자를 확보를 위해 Streptomyces spp SCC-2136의 library 제작 및 염기서열 분석으로부터 14개의 ORF의 확보.


  • 목차(Contents) 

    1. 제출문 ...1
    2. 요약문 ...2
    3. SUMMARY...6
    4. CONTENTS...7
    5. 목차 ...8
    6. 제1장 연구개발과제의 개요 ...9
    7. 제1절 연구개발의 필요성 ...9
    8. 제2절 연구개발의 목표 및 내용 ...13
    9. 제2장 국내외 기술개발 현황 ...1...
    1. 제출문 ...1
    2. 요약문 ...2
    3. SUMMARY...6
    4. CONTENTS...7
    5. 목차 ...8
    6. 제1장 연구개발과제의 개요 ...9
    7. 제1절 연구개발의 필요성 ...9
    8. 제2절 연구개발의 목표 및 내용 ...13
    9. 제2장 국내외 기술개발 현황 ...16
    10. 제1절. 연구사례의 조사 ...16
    11. 제2절 세부 기술사항의 검토 분석 ...18
    12. 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ...19
    13. 제1절. 다양한 당 합성을 위한 plasmid 개발 ...19
    14. 제2절 신규 macrolide의 합성 ...25
    15. 제3절 Deoxysugar 생합성 유전자 집단 발현 연구 ...32
    16. 제4절 NADH cofector recycle system의 확보 ...56
    17. 제5절 TDP-doexysugar 및 TDP-aminosugar 합성 ...58
    18. 제6절 in vitro에서 신규 vancomycin의 합성 ...85
    19. 제7절 Streptomyces 발현벡터의 제작 ...91
    20. 제8절 Deoxysugar 유전자 확보 ...99
    21. 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ...106
    22. 제5장 연구개발결과의 활용계획 ...107
    23. 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ...108
    24. 제7장 참고문헌 ...109
  • 참고문헌

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