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보고서 상세정보

모델세포 S. pombe의 systematic deletion mutant 제조에 의한 위암/간암 관련 유전자의 기능 분석
Functional analysis of the genes involved in stomach/liver cancer using systematic deletion mutants of Schizosaccharomyces pombe.

  • 사업명

    21C 프론티어연구개발사업

  • 과제명

    모델세포 S. pombe의 systematic deletion mutant 제조에 의한 위암/간암 관련 유전자의 기능 분석

  • 주관연구기관

    한국생명공학연구원
    Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology

  • 연구책임자

    원미선

  • 참여연구자

    허광래   장영주   김동욱   정경숙   박조영   최신정   김지연   길영숙   안지희   강은정   김선혜   ...  

  • 보고서유형

    1단계보고서

  • 발행국가

    대한민국

  • 언어

    한국어

  • 발행년월

    2003-07

  • 과제시작년도

    2002

  • 주관부처

    과학기술부

  • 사업 관리 기관

    한국과학재단
    Korea Science and Engineering Foundtion

  • 등록번호

    TRKO201000012125

  • 과제고유번호

    1350003328

  • 키워드

    분열효모.유전자결손돌연변이.위암/간암 관련 유전자.기능보상.약물민감도.Schizosaccharomyces pombe.deletion mutant.stomach/liver cancer related genes.fuctional complementation.drug sensitivity.

  • DB 구축일자

    2013-04-18

  • 초록 


    The 2085 heterozygous genome-wide deletion mutants of S. pombe have been generated using PCR-based targeted mutagenesis. The dele...

    The 2085 heterozygous genome-wide deletion mutants of S. pombe have been generated using PCR-based targeted mutagenesis. The deletion cassettes containing kanMX module as a selection marker, tag sequences as mutant identifiers and the flanking regions of target gene at 5'- and 3'-end were amplified by four-round serial or two round block PCR. The deletion cassettes were replaced at the target site of chromosome of diploid strain SP286 by homologous recombination and the deletions of target genes were confirmed by colony PCR of transformants. We examined drug sensitivity of diploid heterozygous mutants using induced-haploinsufficiency to classify mutants and identifiy drug targets. We tested 15 cytotoxic drugs affecting cell growth by different function using liquid assay using HTS and spot assay of deletion mutants on the plates containing different drugs resulting in identification of 20-40 different targets for each drug. To establish the functional complementation system, haploidization and induced-haploinsufficient phenotype analysis of heterozygous diploid was carried out using psp1 and nda2 diploid mutants as a model system. Also, functional complementation analysis were performed using drug sensitivity by identifying human genes relieving drug sensitivity after overexpression of human cDNA library in deletion mutants. These functional complementation systems can be exploited for the analysis of biological function of the genes related to cancers and diseases and for the functional annotation of unknown genes.
    1. Establishment of method for the generation of systematic genome-wide deletion mutants


    본 연구는 모델세포인 분열효모 S. pombe를 위암/간암 관련 유전자의 기능분석에 활용할 목적으로 genome-wide deletion mutant를 제조하기 시작하였고 제조된 mutants를 이용한 유전자 기능분석 시스템을 확립...

    본 연구는 모델세포인 분열효모 S. pombe를 위암/간암 관련 유전자의 기능분석에 활용할 목적으로 genome-wide deletion mutant를 제조하기 시작하였고 제조된 mutants를 이용한 유전자 기능분석 시스템을 확립하였다.구체적인 연구결과를 나열하면 다음과 같다.
    1. S. pombe의 체계적 deletion mutant 제조 시스템 확립
    -deletion용 strain 선정, 최적의 universal primer, tag sequence 디자인 및 ORF 80 bp 증폭을 위한 primer 디자인 및 합성하였음.
    -deletion cassette 증폭 PCR condition, transformation, colony PCR system 확립함
    2. S. pombe의 대규모 deletion mutant 제조
    확립된 방법을 사용하여 전제 유전자의 43%에 해당하는 2084 종의 deletion mutant를 제조함
    3. 유전자 기능분석 시스템 확립
    -제조된mutant를 12종의 세포독성을 갖는 항암제 또는 항진균제 등의 약물에 대한 민감도를 조사하여 약물타겟 탐색 및 약물민감도에 따른 mutant의 기능적 분류를 수행하였음
    -mutant의 gene lethality와 drug sensitivity를 이용한 functional complementation에 의한 human gene 기능연구 시스템을 확립함.
    4. deletion mutant의 database 시스템 구축
    - S. pombe 유전자 및 deletion mutant에 대한 database 구축함


  • 목차(Contents) 

    1. 표지...1
    2. 제출문...2
    3. 초록...3
    4. 요약문...4
    5. SUMMARY...12
    6. CONTENTS...19
    7. 목차...22
    8. 제1장 서론 ...25
    9. 제2장 국내외 기술개발 현황 ...29
    10. 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ...33...
    1. 표지...1
    2. 제출문...2
    3. 초록...3
    4. 요약문...4
    5. SUMMARY...12
    6. CONTENTS...19
    7. 목차...22
    8. 제1장 서론 ...25
    9. 제2장 국내외 기술개발 현황 ...29
    10. 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ...33
    11. 제1절 실험재료 ...33
    12. 1. Strains ...33
    13. 2. Culture media ...33
    14. 3. Drugs ...33
    15. 4. Oligonucleotides과 RCR ...34
    16. 5. Chemical Reagents ...34
    17. 6. Microscope ...34
    18. 7. Restriction enzymes ...34
    19. 8. Filters ...34
    20. 9. Sequencing ...34
    21. 10. UV crosslinker ...35
    22. 11. Electrophorator ...35
    23. 12. HTS (High Throughput Screening) system ...35
    24. 13. microplate reader ...35
    25. 제2절 실험방법 ...36
    26. 1. E. coli transformation ...36
    27. 2. Deletion cassette 의 제조 ...36
    28. 3. S. pombe transformation ...37
    29. 4. Colony PCR ...38
    30. 5. Mutant stock ...39
    31. 6. S. pombe total RNA 의 분리정제 ...39
    32. 7. S. pombe mRNA 의 분리정제 ...39
    33. 8. 유전자 cloning ...40
    34. 9. Tag sequence의 증폭 ...40
    35. 10. S. pombe chromosomal DNA 의 분리정제 ...41
    36. 11. nda2 mutant의 Drug-induced haploinsufficiency ...42
    37. 12. 대량 약물 스크리닝 ...42
    38. 13. nda2 mutant를 이용한 Functional complementation ...43
    39. 14. S. pombe expression vector로의 human 유전자의 cloning ...44
    40. 15. human library를 이용한 Functional complementation ...44
    41. 16. Random spore analysis ...44
    42. 17. haploid의 제조 ...45
    43. 제3절 결과 및 고찰 ...46
    44. 제1항 ...46
    45. 1-1. strain의 확립 ...46
    46. 1-2. primer design ...46
    47. 1-3. universal primer 결정 ...46
    48. 1-4. deletion cassette 대규모 제조 시스템 확립 ...47
    49. 1-5. 대량 transformation 시스템 확립 ...47
    50. 1-6. Deletion 확인 - colony PCR ...47
    51. 제2항 Deletion mutant 대규모 제조 ...49
    52. 제3항 ...50
    53. 3-1. Tag amplification ...50
    54. 3-2. S. pombe의 haploinsufficiency test ...50
    55. 제4항 ...52
    56. 4-1. Liquid assay ...52
    57. 4-2. Plate assay ...52
    58. 4-3 약물 민감도 검사 ...53
    59. 제5항 ...56
    60. 5-1. Drug sensitivity ...56
    61. 5-2. Gene lethality ...56
    62. 제6항 ...58
    63. 6-1. Human 유전자의 S. pombe 발현 벡터의 클로닝 ...58
    64. 6-2. Human library를 이용한 functional complementation ...58
    65. 제7항 ...59
    66. 7-1. S. pombe 유전자 database 구축 ...59
    67. 7-2. Barcode tag sequence ...59
    68. 7-3. Primer design ...59
    69. 7-4. Mutant database 구축 ...59
    70. 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ...61
    71. 제5장 연구개발 결과의 활용계획 ...64
    72. 제6장 해외 과학기술정보 ...67
    73. 제7장 참고문헌 ...71
  • 참고문헌

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