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생식세포의 후성유전학적 변화 측정을 위한 기술개발 연구
Technology development for assessment of epigenetic changes in germ cell

  • 사업명

    안전성관리기반연구

  • 과제명

    생식세포의 후성유전학적 변화 측정을 위한 기술개발 연구

  • 주관연구기관

    지노믹트리(주)
    GenomicTree.Inc

  • 연구책임자

    오태정

  • 참여연구자

    이승훈  

  • 보고서유형

    최종보고서

  • 발행국가

    대한민국

  • 언어

    한국어

  • 발행년월

    2009-11

  • 과제시작년도

    2009

  • 주관부처

    식품의약품안전청

  • 사업 관리 기관

    식품의약품안전청
    Korea Food & Drug Administration

  • 등록번호

    TRKO201000012297

  • 과제고유번호

    1475004799

  • 키워드

    생식세포.후성유전학.메틸화.측정기술.빈클로졸린.germ cell.epigenetics.methylation.assay technique.vinclozolin.

  • DB 구축일자

    2013-04-18

  • 초록 


    Background & objective: Development of the sensitive detection method to epigenetic changes) (DNA methylation) in germ cells is n...

    Background & objective: Development of the sensitive detection method to epigenetic changes) (DNA methylation) in germ cells is not extensively studied by exposure of environmental hazards. As it recently increased interests on epigenetics in developmental and reproductive toxicology, requirement for detection method development also is evolved among relevant institutes of government, In this study, to provide fundamental technology for evaluating the epigenetic changes, we make an effort on development of technology capable of determining epigenetic alterations by exposure of environmental hazards.
    Method: Gestating mice were given intraperitoneal injections of the representative endocrine disruptor vinclozolin (100 mg/kg/day) to induce reproductive toxicity and epigenetic alterations.
    General characteristics of sperm including motility and shape from F1 -treated male mice and F2 fetus status were examined. Genomic DNA from control and Viz-treated mice was isolated and performed methylation profiling by CpG microarray analysis. Epigenetically changed candidate genes were selected and their methylation status was validated by MeDIA-PCR, pyrosequencing and clonal bisulfite sequencing. In addition, the methylation status of specific target genes and repetitive elements were assessed.
    Results: We confirmed reproductive toxicity through observation of reduced motility, abnormal shape, histology examination, sterility in Fl treated sperms and abnormality of F2 fetus. We discovered more than 100 epigenetically changed candidate genes by novel MeDIA-CpG microarray analysis method and epigenetic changes of selected 18 genes were assessed by novel MeDIA-PCR, pyrosequencing and clonal bisulfite sequencing. Finally, we successfully developed the detection methods for epigenetic change from genome-level to a single gene gene gene g by validating the methylation status of 4 genes. We also validated methylation status of specific marke genes LINE, B1, Dlk1, Pou5f1, Peg1, H19 and Snrpngby pyrosequencing.
    Conclusion: In this study, we developed new detection methods of epigenetic changes occurred in germ cells from genome-level to a single gene by treatment of Viz as a model chemical. Our results will provide important tools for studying epigenetic changes of germ cells by exposure of environmental hazards.


    배경 및 목표: 환경 유해물질들에 의한 후성유전학적 변화, 즉 DNA methylation을 생식세포에서 민감하게 검출할 수 있는 기법 개발에 대한 체계적인 연구는 거의 전무한 상태이며, 최근에 발생 및 생식 독성학 분야에서의 후성...

    배경 및 목표: 환경 유해물질들에 의한 후성유전학적 변화, 즉 DNA methylation을 생식세포에서 민감하게 검출할 수 있는 기법 개발에 대한 체계적인 연구는 거의 전무한 상태이며, 최근에 발생 및 생식 독성학 분야에서의 후성유전학적 변화에 대한 관심이 고조 되면서, 이 분야에 대한 담당 국가기관의 기술 개발에 대한 요구도 증가하고 있음. 따라서 생식세포에 미치는 후성유전학적 영향을 정성적/정량적으로 평가하여 부모세대 및 후세대의 영향을 평가할 수 있는 기술의 개발이 절실히 요구되고 있음. 본 과제에서는 환경 유해물질 노출에 의한 생식세포 대상 지놈수준 및 개별유전자수준의 후성유전학적 변화를 측정할 수 있는 기술을 개발하여 향후 후세대 영향평가를 할 수 있는 기반 기술을 제공하고자 하였음
    방법: 대표적인 내분비 장애물질인 Vinclozolin을 임신중인 암컷 마우스에 투여하여 생식독성 및 후성유전학적 변화를 유도하고, 이로부터 태어난 Fl 수컷 마우스의 정자에 대한 일반적 성질 및 F2 세대의 태자의 상태를 조사하였음. 정상 및 Viz 처리군 정자로부터 DNA를 분리하고 CpG microarray를 이용한 메틸화 프로파일링을 수행하고, 이로부터 메틸화 후보유전자를 선별하고 MeDIA-PCR, Pyrosequencing 및 bisulfite clonal sequencing 방법으로 검증하였음. 특정 유전자 및 repetitive element들에 대한 메틸화 변화 여부도 동일한 3가지 방법으로 측정하였음
    결과: Viz 처리에 의해 정자의 운동성 감소, 정자기형, 정소의 조직학적 이상, 불임유발 그리고 F2 태자의 기형을 확인하여 생식독성 유도를 확인하였음. 신규로 개발된 후생유전학적 측정기술을 이용하여, 100여종 이상의 메틸화 변화 후보유전자들을 발굴하였음.
    후보유전자들 중 18종을 선택하여 MeDIA-PCR, pyrosequencing 및 bisulfite sequencing 방법으로 후생유전학적 변화를 검증하여 생식세포 대상 후성유전학적 변화 측정기술을 확립하였음. 최종적으로 4종의 유전자에 대한 후생유전학적 변화를 검증하여 지놈 수준부터 개별 유전자 수준까지 생식세포 대상 메틸화 측정이 가능함을 확인하였음. 특정지표 유전자에 대한 메틸화 검증은 pyrosequencing 방법으로 LINE, B1, Pou5f1, Dlk1, H19, Peg1, Snrpn 그리고 Slc20al 유전자들을 검증하였음
    결론: 본 연구에서는 Viz를 모델물질로 하여 생식세포에서 일어나는 후생유전학적인 변화를 지놈수준부터 개별유전자 수준까지 측정이 가능한 기술을 확립하였고, 향후 환경 유해물질에 의해 생식세포의 후성유전학적 변화를 연구하는 중요한 도구를 제공해 줄 것임


  • 목차(Contents) 

    1. 총괄연구개발과제 연구결과 ... 10
    2. 제 1 장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 10
    3. 제 2 장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ... 16
    4. 제 3 장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ... 26
    5. 제 4 장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...
    1. 총괄연구개발과제 연구결과 ... 10
    2. 제 1 장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 10
    3. 제 2 장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ... 16
    4. 제 3 장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ... 26
    5. 제 4 장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 52
    6. 제 5 장 총괄연구개발과제의 연구성과 ... 60
    7. 제 6 장 기타 주요변경사항 ... 62
    8. 제 7 장 참고문헌 ... 63
    9. 제 8 장 첨부서류 ... 64
    10. 제 1 세부연구개발과제 연구결과 ... 65
    11. 제 1 장 제 1 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 66
    12. 제 2 장 제 1 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 69
    13. 제 3 장 제 1 세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ... 76
    14. 제 4 장 제 1 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 97
    15. 제 5 장 제 1 세부연구개발과제의 연구성과 ... 102
    16. 제 6 장 기타 주요변경사항 ... 104
    17. 제 7 장 참고문헌 ... 105
    18. 제 8 장 첨부서류 ... 106
    19. 제 2 세부연구개발과제 연구결과 ... 107
    20. 제 1 장 제 2 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 108
    21. 제 2 장 제 2 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 111
    22. 제 3 장 제 2 세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ... 113
    23. 제 4 장 제 2 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 118
    24. 제 5 장 제 2 세부연구개발과제의 연구성과 ... 119
    25. 제 6 장 기타 주요변경사항 ... 121
    26. 제 7 장 참고문헌 ... 122
    27. 제 8 장 첨부서류 ... 123
  • 참고문헌

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