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동물대체시험법 개발 및 검증 연구 - 안점막자극시험, 피부감작성시험, 피부흡수 및 투과시험 대체시험법 연구
Development of in vitro alternatives ; eye-irritation, skin sensitization and skin absorption & penetration

  • 사업명

    안전성관리기반연구

  • 과제명

    동물대체시험법개발및검증 연구-안점막자극시험, 피부감작성, 피부흡수 및 투과시험대체시험법 연구

  • 주관연구기관

    (주)메드빌
    Medvill Co., Ltd

  • 연구책임자

    정영신

  • 보고서유형

    최종보고서

  • 발행국가

    대한민국

  • 언어

    한국어

  • 발행년월

    2009-12

  • 과제시작년도

    2009

  • 주관부처

    식품의약품안전청

  • 사업 관리 기관

    식품의약품안전청
    Korea Food & Drug Administration

  • 등록번호

    TRKO201000012329

  • 과제고유번호

    1475005121

  • 키워드

    동물대체시험법.Animal alternatives to animal experiments.

  • DB 구축일자

    2013-04-18

  • 초록 


    $\bullet$ According to the animal protection and animal ethics in Europe, the concept of 3R (replacement, reduction, r...

    $\bullet$ According to the animal protection and animal ethics in Europe, the concept of 3R (replacement, reduction, refinement) were conducted and in vitro alternatives were vigorously developed in the world. Since animal ethics was applied to the development of cosmetic products through the enforcement of $7^{th}$ Amendment to the Cosmetics Directive and to chemical registration through REACH regulation, the development of alternatives has been a hot issue to the toxicologist.
    $\bullet$ Thus, the present researches were conducted to develop in vitro alternatives, especially eye-irritation, skin sensitization, skin absorption & penetration for domestic guideline and regulation. Test conditions were properly optimized and validated within laboratory and between laboratories. Through holding open workshop, the test methods were transferred to many domestic scientists.
    $\bullet$ For eye-irritation, the optimizations for the incubation and experimental condition of reconstituted corneal model were carried out. The viabilities were measured using WST method and $IC_{50}$ used for evaluation of irritation criteria. Twenty two test materials were properly evaluated and accuracy was 86.4%. Correlations among three different laboratories were tested for interlaboratory validation and significant P value less than 0.001. This eye-irritation alternative showed good predictability power.
    $\bullet$ Human monocytic cell line (THP-1) culture, or human skin equivalent coculture was used in order to establish the in vitro alternative for the evaluation of skin sensitizer. Using the previously established method for THP-1 culture, more test materials (17 materials including false positive, false negative test materials and cosmetics) and additional biomarkers were tested. As results, the accuracy was estimated over 70%, whereas the accuracy of same test materials was less 70% in h-CLAT. Various markers could be chosen in different strategy. In order to overcome the limitation of in vitro single cell assay, human skin equivalent (Keraskin, MCTT) and THP-1 were employed in a coculture system and a few study measuring similar biomarkers conducted. According to the results from coculture experiments using 7 test materials, the predictability may increase and further study needed.
    $\bullet$ Murine local lymph node assay (LLNA, OECD 429) using radioactive compound have been used in the world as an animal alternative since the reduction and refinement were applied in this test. Non-radio active method was developed using Flow cytometry (FACS), immunohistochemistry and ELISA measurement. In present study, flow cytometry measurement within optimized and validated within and between laboratories. Repeatability within laboratory and correlation between two laboratories were well established.
    $\bullet$ Test method for skin absorption and penetration (OECD 428) were well established using pig ear skin, human skin and two human equivalent skins in the present study. Human equivalent skin developed by MCTT (Korean company) showed benefit for water soluble compound.


    $\bullet$ EU 공동체에서 주도된 동물보호 및 동물윤리에 따라 실험동물사용에 3R (replacement, reduction, refinement) 원칙이 도입되었고, 결과적으로 동물을 대체하여 사용할 수...

    $\bullet$ EU 공동체에서 주도된 동물보호 및 동물윤리에 따라 실험동물사용에 3R (replacement, reduction, refinement) 원칙이 도입되었고, 결과적으로 동물을 대체하여 사용할 수 있는 실험 모델을 개발하기 위한 연구가 전세계적인 관심사가 되었다. EU에서는 2009년 3월 11 일 부터 화장품 개발을 위한 연구에서 동풍을 사용하지 못하도록 규제하였고 동물실험에 의해 개발된 화장품은 판매도 하지 못하도록 규제하기 시작하였다($7^{th}$ Amendment to the Cosmetics Directive). 또한, EU의 기존화학물질 등록에 대한 HEACH 법에서도 대체시험법을 사용하도록 하고 있어서, 이에 따른 동물대체시험에 대한 연구와 규제기관의 국내 시험 가이드라인 설정이 시급한 설정이다.
    $\bullet$ 이러한 국내 외 정세에 따라, 본 연구에서는 안전성시험 중 동물대체시험법 개발이 시급한, 안점막작극시험, 피부감작성시험 및 피부흡수 투과 관련 시험법을 확립하고 실험실내 및 실험실간 검증시험을 진행함으로서 국내 시험법 가이드라인 제정에 기여하고 워크샵을 통하여 국내 관련 연구자들에게 시험법을 전수함으로써 국내 외 정세에 대처하도록 하였다.
    $\bullet$ 안점막자극 대체시험법으로 인공각막을 사용하는 방법을 국내 제작 인공각막을 사용하여 확립하였으며 실험실내 및 실험실간 예비 검증실험을 수행하였다. 인공각막의 최적배양조건을 확립하고, 시험물질을 자극하였을 때, 세포사멸 여부측정에 새로운 방법 (WST 시험법)올 도입하여 검증하였고, 22개의 물질을 처리하여 결과를 비교함으로서 실험실내 검증을 수행하였다. 4개 물질에 대하여 3기관에서 동시에 실험을 진해하여 실험실간에 높은 일치도를 도출함으로서 대체시험법 가능성을 확인하였다.
    $\bullet$ 피부감작성 대제시험법으로는 THP-1 (human monocytic cell line) 세포주로 기확립된 시험법에 대하여 새로운 물질(위양성, 위음성 화학물질 및 화장품 원료 포함 17 종) 및 마커의 다양화를 통하여 시험법의 판정정확성을 높이려 하였고 판정 정확도가 70% 이상으로 확인되었다. 또한, 피부감작성의 투과, 반응, 면역세포 자극 등의 일련의 반응이 효과적으로 반영될 수 있도록 인공피부와 세포주의 공동배양법을 연구하였다. 7가지 물질로 판정 정확성을- 높일 수 있는 가능성은 타진 되였으나, 더 많은 물질의 시험이 필요한 것으로 사료된다.
    $\bullet$ 피부감작성 시험의 in vitro 대체시험 연구가 진행되는 동안, 동물의 수 및 고통을 줄이는 (reduction & refinement) 차원에서 국제적으로 인정되고 있는 "마우스를 활용한 국소림프절시험법"의 방사선동위원소 사용 문제를 극복하기 위하여 비방사선 시험법 중 BrdU를 이용한 방법을 연구하였다. BrdU 증식능을 측정하는 flow cytometry (FACS), 면역화학법, ELISA 방법을 비교하였고 FACS 시험법에 대한 최적조건을 완성하였다. 또한, FACS 방법으로 7개 물질에 대한 2개기관의 실험실간 검증실험을 실시하였고 결과 판정에 있어서 일치성과 반복성을 확인하였다.
    $\bullet$ 피부 흡수 및 투과시험에서 돼지피부, 연체피부, 인공피부 국내제작 포함 2건으로 비교시험을 진행함으로써 국내에서 시험법을 확립하였고 국내제작 인공피부 사용 가능성을 높였다.


  • 목차(Contents) 

    1. 용역연구개발과제 최종보고서...1
    2. 표지...2
    3. 제출문...4
    4. 목차...5
    5. I. 총괄연구개발과제 요약문...8
    6. 국문 요약문...8
    7. Summary...10
    8. II. 총괄연구개발과제 연구결과 ...12
    9. 제1장 총괄연구개발과제의 목적 및 필요성 ...
    1. 용역연구개발과제 최종보고서...1
    2. 표지...2
    3. 제출문...4
    4. 목차...5
    5. I. 총괄연구개발과제 요약문...8
    6. 국문 요약문...8
    7. Summary...10
    8. II. 총괄연구개발과제 연구결과 ...12
    9. 제1장 총괄연구개발과제의 목적 및 필요성 ...12
    10. 1.1 총괄연구개발과제의 목표...12
    11. 1.2 총괄연구개발과제의 목표달성도...17
    12. 1.3 총괄국내?외 기술개발 현황...18
    13. 제2장 총괄연구개발과제의 내용 및 방법 ...21
    14. 2.1 연구개발과제의 내용...21
    15. 2.2 연구개발과제의 연구방법...25
    16. 제3장 총괄연구개발과제의 최종결과 및 고찰 ...46
    17. 3.1 THP-1 세포주를 활용한 피부감작성 대체시험법 및 인공피부를 활용한 새로운 시험법 개발 연구...46
    18. 3.2 비방사선 국소림프절 시험법(LLNA) 연구 및 검증...57
    19. 3.3 인공각막모델을 이용한 안점막자극시험...66
    20. 3.4 피부흡수 및 투과시험 대체시험법 연구...78
    21. 제4장 총괄연구개발과제의 연구성과 ...83
    22. 4.1 총괄활용성과...83
    23. 4.2 총괄활용계획...86
    24. 제5장 총괄주요연구 변경사항 ...86
    25. 제6장 총괄참고문헌 ...86
    26. 제7장 총괄첨부서류 ...87
    27. III. 제 1세부연구개발과제 연구결과 ...108
    28. 제1장 세부연구개발과제의 요약문 ...109
    29. 제2장 세부연구개발과제의 목적 ...111
    30. 2.1 세부연구개발과제의 목적...111
    31. 2.2 세부연구개발과제의 목표달성도...113
    32. 제3장 세부연구개발과제의 내용 및 방법 ...116
    33. 3.1 연구내용...116
    34. 3.2 연구방법...118
    35. 제4장 세부연구개발과제의 결과 및 고찰 ...125
    36. 4.1 연구결과 및 고찰...125
    37. 4.2 연구개발의 결론...140
    38. 제5장 세부참고문헌 ...141
    39. IV. 제 2세부연구개발과제 연구결과 ...145
    40. 제1장 세부연구개발과제의 요약문 ...146
    41. 제2장 세부연구개발과제의 목적 ...148
    42. 2.1 세부연구개발과제의 목적...148
    43. 2.2 세부연구개발과제의 목표달성도...150
    44. 제3장 세부연구개발과제의 내용 및 방법 ...153
    45. 3.1 연구내용...153
    46. 3.2 연구방법...154
    47. 제4장 세부연구개발과제의 결과 및 고찰 ...162
    48. 4.1 BrdU를 이용한 비방사선 국소림프절 시험법의 검증...162
    49. 4.2 세포표면항원 발현수준을 이용한 비방사선국소림프절 시험법의 검증...168
    50. 4.3 실험실간 검증...173
    51. 4.4 세부연구개발과제의 고찰 및 결론...179
    52. 제5장 세부참고문헌 ...184
    53. V. 제 3세부연구개발과제 연구결과 ...187
    54. 제1장 세부연구개발과제의 요약문 ...188
    55. 제2장 세부연구개발과제의 목적 ...190
    56. 2.1 세부연구개발과제의 목적...190
    57. 2.2 세부연구개발과제의 목표달성도...192
    58. 제3장 세부연구개발과제의 내용 및 방법 ...194
    59. 3.1 연구내용...194
    60. 3.2 연구방법...195
    61. 제4장 세부연구개발과제의 결과 및 고찰 ...201
    62. 4.1 인공각막모델의 배양 최적 조건 확립 시험(Phase Ⅰa)...201
    63. 4.2 인공각막모델을 이용한 안점막자극시험 조건 확인 시험(Phase Ⅰb)...206
    64. 4.3 인공각막모델을 이용한 안점막자극시험의 실험실간 검증 (Phase Ⅱ)...210
    65. 제5장 세부창고문헌 ...214
    66. VI. 제 4세부연구개발과제 연구결과 ...215
    67. 제1장 세부연구개발과제의 요약문 ...216
    68. 제2장 세부연구개발과제의 목적 ...218
    69. 2.1 세부연구개발과제의 목적...218
    70. 2.2 세부연구개발과제의 목표달성도...219
    71. 제3장 세부연구개발과제의 내용 및 방법 ...220
    72. 3.1 연구내용...220
    73. 3.2 연구방법...220
    74. 제4장 세부연구개발과제의 결과 및 고찰 ...224
    75. 4.1 연구개발과제의 결과...224
    76. 4.2 연구개발과제의 고찰...227
    77. 제5장 세부참고문헌 ...229
  • 참고문헌

    1. 전체(0)
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