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보고서 상세정보

Bacillus cereus에 의한 구토형 및 설사형 독소 동시 신속검출기법 개발
Establishment of a multiplex PCR assay and detection of enterotoxic and emetic Bacillus cereus

  • 사업명

    식품 등 안전관리

  • 과제명

    Bacilluscereus에 의한 구토형 및 설사형 독소 동시 신속검출 기법개발

  • 주관연구기관

    강원대학교
    Kangwon National University

  • 연구책임자

    오덕환

  • 보고서유형

    최종보고서

  • 발행국가

    대한민국

  • 언어

    한국어

  • 발행년월

    2009-11

  • 과제시작년도

    2009

  • 주관부처

    식품의약품안전청

  • 사업 관리 기관

    식품의약품안전청
    Korea Food & Drug Administration

  • 등록번호

    TRKO201000014627

  • 과제고유번호

    1475005148

  • 키워드

    바실러스 세레우스.구토 독소.위해 평가.Bacillus cereus.Eemtic toxin.PCR primer.Risk assesment.

  • DB 구축일자

    2013-04-18

  • 초록 


    Bacillus cereus can cause diarrheal and emetic types of food poisoning but little study has been done
    on emetic type of food p...

    Bacillus cereus can cause diarrheal and emetic types of food poisoning but little study has been done
    on emetic type of food poisoning in Korea. This study was to report an emetic type of food poisoning
    associated with B. cereus. The risk of emetic type B. cereus food poisoning has existed in Korea. 40 emetic
    B. cereus among 160 strains was determined using HPLC/MS analysis. NHE and HBL enterotoxins among
    emetic strains (n=40) were produced 31 (77.5%) and 3 (7.5%). The positive of starch hydrolysis, salicin
    fermentation and hemolysis among emetic strains were 3 (7.5%), 3 (7.5%) and 26 (65.0%), respectively. The
    absence of HBL enterotoxin and phenotypic property such as starch hydrolysis and salicin fermentation is not
    critical characteristics of the emetic B. cereus tested in this study. The detection rate of nheABC, hblCDA,
    entFM and cytK gene among enterotoxic B. cereus strains was 94.2, 89.2, 65.8, and 52.5%, respectively. All
    enterotoxic B. cereus strains used in this study carried at least one of the nine toxin genes tested. The
    detection rate of nheABC, hblCDA, entFM, and cytK gene among emetic B. cereus strains was in 82.5, 7.5,
    50.0, and 27.5%, respectively. 34 (85.0%) of 40 emetic B. cereus can cause diarrheal and emetic type of
    food poisoning simultaneously. The emetic toxin and enterotoxin should be constantly detected to analysis the
    direct factor of B. cereus food poisoning exactly. A total 17 distinct pulsotypes was obtained from the RAPD
    and the PFGE banding patterns, respectively. Emetic B. cereus Korean isolates showed diverse pulsotypes
    based on the RAPD and the PFGE banding patterns. All strains were resistant to β-lactam antibiotics such
    as penicillin and ampicillin. Combining phenotypes, PFGE types, RAPD types and antibiotic resistance types,
    a total of 7 composite groups were found. Emetic B. cereus isolated in Korea showed phenotypic and
    genotypic diversity comparing the previous studies. All of the species-specific PCR assays were shown to be
    highly specificity, but the sensitivity of the assays varied greatly. The sensitivity of CER primer showed the
    most highly sensitivity (100 %) than the other primers tested and CES primer had a specificity of 100 %.
    The multiplex-PCR primers detecting diarrheal and emetic toxin producing B. cereus including nheA, hblC,
    entFM, cytK, CER and CES genes were designed and developed. The PCR primers showed 100% sensitivity
    for detection of emetic strain and only 1.7% false positive for 120 enterotoxic B. cereus strains. Also,
    detection limit of the PCR primers were ranged from $8.8{\times}10^{1}$ to $7.2{\times}10^{2}$ in TSB and from $4.3{\times}10^{3}$to
    $8.8{\times}10^{3}$ in defatted milk, respectively. Thus, This developed PCR assay might consider as useful tool for
    rapid and specific screening method for detection of emetic and enterotoxin producing B. cereus before
    performing laborious and costly methods.


    Bacillus cereus는 설사형과 구토형 식중독을 발생시키나 현재까지 국내에서는 구토형 식중독에 관해
    연구가 전무한 실정이다. 본 연구결과 B. cereus에 의한 구토형 식중독 사건을 확인하였으며 이러한
    결과로부터...

    Bacillus cereus는 설사형과 구토형 식중독을 발생시키나 현재까지 국내에서는 구토형 식중독에 관해
    연구가 전무한 실정이다. 본 연구결과 B. cereus에 의한 구토형 식중독 사건을 확인하였으며 이러한
    결과로부터 구토형 B. cereus에 의한 식중독 위험성이 국내에 상존함을 파악할 수 있었다. 식품(떡, 김
    밥) 및 환자가검물에서 160균주의 B. cereus를 분리, 수집하였으며 HPLC/MS를 이용하여 40주의 구토
    형과 120주의 설사형 B. cereus를 각각 동정하였다. 구토형 B. cereus (40주)의 NHE 및 HBL 설사독
    소 생산능은 31주 (77.5%)와 3주 (7.5%)로 나타났다. 40주의 구토형 B. cereus는 starch hydrolysis,
    salicin fermentation 및 hemolysis를 각 3주 (7.5%), 3주 (7.5%) 및 26주 (65.0%)가 분해하여 이들을 구
    토형 B. cereus의 생물학적 마커로 사용하기에는 한계가 있는 것으로 나타났다. 설사형 B. cereus의
    nheABC, hblCDA, entFM 및 cytK gene분포 현황은 94.2, 89.2, 65.8 및 52.5%로 나타났으며 구토형
    B. cereus의 nheABC, hblCDA, entFM 및 cytK gene분포 현황은 82.5, 7.5, 50.0 및 27.5%로 나타났
    다. 본 실험에 사용된 160주의 B. cereus 균주는 한 개 이상의 독소 유전자를 가지고 있어 국내에서
    분리되는 B. cereus는 식중독 원인균주임을 확인하였다. 또한 34주 (85.0%)의 구토형 B. cereus는 설사
    독소와 구토독소를 동시에 함유하고 있어 설사형 식중독과 구토형 식중독을 동시에 발생시킬 수 있으
    며, 구토형 B. cereus의 정확한 동정을 위해서는 반드시 설사독소와 구토독소를 동시에 분석하여야 할
    것으로 판단되었다. RAPD와 PFGE의 banding pattern을 분석한 결과, 17 pulsotypes을 확인하였으며
    국내 분리 구토형 B. cereus는 유전적으로 다양한 형태를 나타냈다. 구토형 B. cereus 균주는 β
    -lactam 항생제 penicillin and ampicillin 등에 내성을 나타냈다. 기존에 보고된 구토형 B. cereus 검출
    PCR primer들은 특이도는 높게 나타났으나 민감도는 낮은 결과를 나타내었다. 본 실험결과, CER
    primer와 CES primer가 가장 뛰어난 민감도 (100%)와 특이도 (100%)를 나타내었다. 본 연구에서는
    nheA, hblC, entFM, cytK, CER,CES gene을 대상으로 설사독소와 구토독소를 동시에 검출할 수 있
    도록 primer들을 새롭게 디자인하여 구토독소와 설사독소 유전자를 동시에 검출하는 multiplex-PCR
    primers를 개발하였으며 그 결과, 모든 구토형 B. cereus 균주는 100% 민감도를 나타내었으나, 120개
    의 설사형 균주에서는 2주가 위양성이 나타났다. 한편, 개발된 multiplex PCR의 최소검출한계는 균주
    별로 약간 차이가 있었지만 TSB에서는 $8.8{\times}10^{1}$$7.2{\times}10^{2}$, 탈지유에서는 $4.3{\times}10^{3}$$8.8{\times}10^{3}$으로 나타
    났다. 따라서, 본 연구에서 개발한 multi-PCR pimer kit는 설사독소와 구토독소생성 B. cereus를 동시
    에 검출할 수 있으며 독소형 B. cereus 검출 스크린용으로는 매우 좋은 것으로 나타났다.


  • 목차(Contents) 

    1. 최종보고서 ...1
    2. 제출문 ...4
    3. 목차 ...5
    4. I. 총괄연구개발과제 요약문 ...5
    5. 1. 국문요약문 ...7
    6. 2. 영문요약문 ...9
    7. II. 총괄연구개발과제 연구결과 ...11
    8. 제1장 총괄연구개발과제의 목적 및 필요성 ...11
    9. 1...
    1. 최종보고서 ...1
    2. 제출문 ...4
    3. 목차 ...5
    4. I. 총괄연구개발과제 요약문 ...5
    5. 1. 국문요약문 ...7
    6. 2. 영문요약문 ...9
    7. II. 총괄연구개발과제 연구결과 ...11
    8. 제1장 총괄연구개발과제의 목적 및 필요성 ...11
    9. 1.1 총괄연구개발과제의 목표...11
    10. 1.2 총괄연구개발과제의 목표달성도...18
    11. 1.3 총괄 국내?외 기술개발 현황...19
    12. 제2장 총괄연구개발과제의 내용 및 방법 ...24
    13. 2.1. 실험재료 및 균주...24
    14. 2.2. 실험 방법...25
    15. 제3장 총괄연구개발과제의 최종결과 및 고찰 ...33
    16. 3.1. 식품 중 B. cereus 분리 동정 및 구토독소 생산 확인...33
    17. 3.2. B. cereus의 생물형 및 유전형 분석...40
    18. 3.3. B. cereus의 독소유전자 및 독소 생산 분석...50
    19. 3.4. B. cereus의 구토 및 설사독소 동시 검출 PCR primer kit 개발...61
    20. 제4장 총괄연구개발과제의 연구 성과 ...74
    21. 4.1 총괄활용성과...74
    22. 4.2 총괄활용계획...76
    23. 제5장 총괄주요연구 변경사항 ...77
    24. 제6장 총괄참고문헌 ...78
    25. 제7장 총괄첨부서류 ...82
    26. III. 제1세부연구개발과제 연구결과 ...84
    27. 제1장 세부연구개발과제의 요약문 ...84
    28. 제2장 세부연구개발과제의 목적 ...86
    29. 2.1 세부연구개발과제의 목적...86
    30. 2.2 세부연구개발과제의 목표달성도...91
    31. 제3장 세부연구개발과제의 내용 및 방법 ...92
    32. 3.1. 실험재료 및 균주...92
    33. 3.2. 실험 방법...93
    34. 제4장 세부연구개발과제의 결과 및 고찰 ...97
    35. 4.1. 식품 중 B. cereus 분리 동정...97
    36. 4.2. B. cereus의 독소유전자 분석 및 독소 생산 분석...98
    37. 4.3. B. cereus의 구토 및 설사독소 동시 검출 PCR primer kit 개발...104
    38. 제5장 세부참고문헌 ...117
    39. Ⅳ. 제2세부연구개발과제 연구결과 ...122
    40. 제1장 세부연구개발과제의 요약문 ...122
    41. 제2장 세부연구개발과제의 목적 ...124
    42. 2.1 세부연구개발과제의 목적...124
    43. 2.2 세부연구개발과제의 목표달성도...128
    44. 제3장 세부연구개발과제의 내용 및 방법 ...129
    45. 3.1. 실험 균주...129
    46. 3.2. 실험 방법...130
    47. 제4장 세부연구개발과제의 결과 및 고찰 ...135
    48. 4.1. B. cereus 구토독소 생산 확인...135
    49. 4.2. B. cereus의 생물형 및 유전형 분석...142
    50. 4.3. B. cereus의 독소 생산 분석...152
    51. 제5장 세부참고문헌 ...156
  • 참고문헌

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