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보고서 상세정보

유방암의 다제 약물 내성 생체지표 발굴 및 그 유용성 검증
Identification of biomarkers for multidrug resistance and validation of markers in breast cancer tissue

  • 사업명

    안전성관리기반연구

  • 과제명

    단백체 기술을 이용한 항암제의 내성 발현 예측 및 검증 연구

  • 주관연구기관

    연세대학교 의과대학
    Yonsei University

  • 연구책임자

    김건홍

  • 참여연구자

    김정희   최향태   신순철   이재정   남명희   서종복   정주희   김혜숙   이진희   이은경  

  • 보고서유형

    최종보고서

  • 발행국가

    대한민국

  • 언어

    한국어

  • 발행년월

    2007-11

  • 과제시작년도

    2007

  • 주관부처

    식품의약품안전청

  • 사업 관리 기관

    식품의약품안전청
    Korea Food & Drug Administration

  • 등록번호

    TRKO201000014828

  • 과제고유번호

    1475003575

  • 키워드

    유방암.다약제 내성.생체지표.단백체학.면역염색.Breast Cancer.Multidrug resistance.Biomarker.Proteomics.Immunohistochemistry.

  • DB 구축일자

    2013-04-18

  • 초록 


    1) Bcl-2 and Bax were not direct substrates of PKCK2. PKCK2 may indirectly influence on Bcl-2 and Bax. Bcl-w was a direct substat...

    1) Bcl-2 and Bax were not direct substrates of PKCK2. PKCK2 may indirectly influence on Bcl-2 and Bax. Bcl-w was a direct substate of PKCK2 and it was phophorylated in in vitro kinase assay. We are now trying to determine the phosphorylation site in Bcl-w.
    2) Breast cancer cell lines were screened for multidrug resistance. MDAMB231 cells were resistant to single drug treatment and were also resistant to the combination of 2 or 3 cancer drugs. In contrast, T47D cells were killed even by a single drug treatment. We defined MDAMB231 cells as a multidrug resistant cancer cells and T47D cells as a chemosensitive cells. We made protein map using proteins obtained from T47D. When we compared differential expression of proteins between MDAMB-231 and T47D cells, we found some proteins that showed difference. Some of them are NDRG-1, PAR-4, TASK-2, and BAP-1. Then, we performed western blot analysis to confirm the result from 2-D gel electrophorsis. We confirmed the differential expression and then, we performed western analysis using lysates obtained from formalin fixed paraffin embedded primary cancer tissue sections. PAR-4 was less expressed in MDAMB-231 than T47D cells but there was no correlation between drug responsiveness and PAR-4 expression level. We are going to analyze another target. At present, we don't have a kit because it has been back-orderd. As soon as we got the kit, we will get more proteins from each tissue sections.
    3) For primary cancer tissues, we analyzed 55 cases. Phospho Bcl-2 was negative only in 7 cases. We defined drug sensitive as when growth of cancer cells from each patient were inhibited more than 35 % by each drug. (Drugs selected were as follows: 5-FU, 5-FU, Doxorubicin, Epirubicin, Docetaxel, Paclitaxel). We also defined drug responder as when more than 3 drugs showed drug sensitivity on each patient case.4 out of 7 phospho Bcl-2 negative cases were drug responder and 13 out of 48 phopho Bcl-2 positive cases were drug responder. We found that when phopho-bcl-2 was positive, the sensitivity toward paclitaxel were specifically and meaninfully were decreased. Accordinly, the information on the status of Bcl-2 phosphorylation could provide doctor a useful guideline to choose anti-cancer drug(s).


    항암제 내성에 관여하는 단백체의 발현 프로파일 분석결과를 기반으로 항암제의 내성발현 예측을 목표로 수행한 본 용역연구과제 연구를 통해 본 연구진은 다음과 같은 결과들을 얻을 수 있었음.
    1) PKCK2 억제제 처치시 세포질...

    항암제 내성에 관여하는 단백체의 발현 프로파일 분석결과를 기반으로 항암제의 내성발현 예측을 목표로 수행한 본 용역연구과제 연구를 통해 본 연구진은 다음과 같은 결과들을 얻을 수 있었음.
    1) PKCK2 억제제 처치시 세포질에서 마이토콘드리아로 이동하여 항암제에대한 민감성을 증가시킬것으로 생각되는 Bax 단백질의 PKCK2 기질 여부를 판정한 결과 Bax는 PKCK2의 기질이 아니었음. Bcl-2는 PKCK2 억제제에 의해 인산화상태가 변화하였으나, PKCK2의 직접적인 기질은 아니었음. Bcl-2의 인산화 상태와 다약제 내성과의 연관성을 확인한 결과 phospho Bcl-2가 존재하는 경우 항암제, 특히 Paclitaxel에 대한 감수성이 유의하게 감소하는 것을 확인하였음. Anti-apoptotic Bcl-w의 발현이 PKCK2 억제시 소멸하는 것을 근거로 하여 Bcl-w가 PKCK2의 기질임을 확인한 결과 Bcl-w는 PKCK2에 의해 인산화되었음. 인산화부위를 결정하기위해 (주) 제노마인에 의뢰하였으나, 아직 인산화 부위를 결정하지 못하고 있는 상태임. Bcl-w의 발현과 항암제 감수성과의 연관성은 존재하지 않았음.
    2) 유방암 치료를 위해 사용하는 항암제에 대한 민감성 정도를 분석한 결과 MDAMB-231세포는 단일 항암제 처치, 두가지 약제 병용 처치 및 세가지 약제 병용 처치에서도 상대적으로 내성을 나타내는 반면, T47D세포는 cisplatin을 제외한 약물의 단일 처치에서도 민감하게 세포사멸이 진행되었으며, 병용 처치시 매우 민감하게 세포사멸이 진행되었음. MDAMB-231세포를 다약제 내성 암세포주, T47D 세포를 다약제 민감성 세포주로 규정하고 단백질을 추출하여 프로테오믹스 실험을 진행하였음. T47D 세포의 단백체를 이용하여 단백체 지도를 작성하였으며, 발현의 차이를 나타내는 단백체를 동정하였음. NDRG-1, PAR-4, TASK-2 및 BAP-1 단백체의 경우 MDAMB231 세포에서 그 발현이 감소하였으며, 재검증을 위해서 각 단백체에 대한 항체를 이용하여 두 세포주간 단백발현 정도를 웨스턴 분석한 결과 이차원 전기영동상에서 확인한 결과를 재검증할 수 있었음. 이 결과를 근거로 하여 CRA 결과 4가지 이상의 약물에 대해서 각각 35%이상의 cell growth inhibition rate를 보이는 환자들의 조직절편 및 4가지 이상의 약물에 대해서 35% 미만의 cell growth inhibition rate를 보이는 환자들의 조직절편으로부터 단백질을 추출한 후 웨스턴 분석을 시행하였음. 단백질 양이 극히 미량 추출되어 현재 PAR-4에 대한 분석만이 완료되었음. 단백질 추출 키트 및 NDRG-1 항체가 반복적으로 back order되어 현재 실험 진행이 정지된 상태임. PAR-4의 발현양상과 항암제 내성과의 연관성은 없는 것으로 판단됨. 다른 단백체에 대한 웨스턴 분석을 시행할 예정임.
    3) CRA 분석에 반복적이고 공통적으로 사용된 약제는 5-FU, Doxorubicin, Epirubicin, Docetaxel, Paclitaxel 이었음. CRA 결과에서 각 항암제에 대해 cell growth inhibition rate가 35% 이상인 경우 그 환자는 해당 약물에 대해 drug sensitive 하다고 정의하였으며, 35% 미만인 경우 drug resistant로 정의하였음. 또한 한 환자의 암세포가 3가지 이상의 약물에 대해 Drug sensitive 한 경우를 Drug responder로 정의하였으며, 3종류 미만에 대해 drug sensitve 한 경우 Drug non-responder로 정의하였음. phospho Bcl-2는 CRA 결과가 확보된 총 55예중 7예에서 음성이었으며, 48예에서 양성이었음. 음성인 7예중 4예는 drug responder 였으며, 양성인 48예중에서는 13예만이 drug responder 였음. phospho Bcl-2가 존재하는 경우 항암제, 특히 Paclitaxel에 대한 감수성이 유의하게 감소하는 것을 확인하였음. 따라서 향후 phospho Bcl-2의 면역염색 결과는 종양임상의로 하여금 유방암 수술후 시행되는 항암화학요법 과정에서 항암제 선택의 기준을 제시할 수 있는 유용한 biomarker로 사용될 수 있을 것이라고 판단됨.


  • 목차(Contents) 

    1. 용역연구사업 연구결과보고서 ...1
    2. 제출문 ...2
    3. 목차 ...3
    4. I. 연구개발결과 요약문 ...5
    5. 연구결과보고서 요약문...5
    6. Summary ...7
    7. II. 총괄연구개발과제 연구결과 ...8
    8. 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...8...
    1. 용역연구사업 연구결과보고서 ...1
    2. 제출문 ...2
    3. 목차 ...3
    4. I. 연구개발결과 요약문 ...5
    5. 연구결과보고서 요약문...5
    6. Summary ...7
    7. II. 총괄연구개발과제 연구결과 ...8
    8. 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...8
    9. 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ...12
    10. 제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...14
    11. 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...44
    12. 제5장 총괄연구개발과제의 연구성과 ...48
    13. 제6장 기타 중요변경사항 ...50
    14. 제7장 참고문헌 ...54
    15. 제8장 첨부서류 ...56
    16. III. 제1세부연구개발과제 연구결과 ...57
    17. 제1장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...58
    18. 제2장 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ...63
    19. 제3장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...64
    20. 제4장 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...68
    21. 제5장 세부연구개발과제의 연구성과 ...69
    22. 제6장 기타중요변경사항 ...71
    23. 제7장 참고문헌 ...71
    24. 제8장 첨부서류 ...72
    25. IV. 제2세부연구개발과제 연구결과 ...73
    26. 제1장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...74
    27. 제2장 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ...80
    28. 제3장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...83
    29. 제4장 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...100
    30. 제5장 세부연구개발과제의 연구성과 ...102
    31. 제6장 기타중요변경사항 ...104
    32. 제7장 참고문헌 ...105
    33. 제8장 첨부서류 ...106
    34. V. 제3세부연구개발과제 연구결과 ...107
    35. 제1장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...108
    36. 제2장 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ...109
    37. 제3장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...114
    38. 제4장 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...121
    39. 제5장 세부연구개발과제의 연구성과 ...122
    40. 제6장 기타중요변경사항 ...123
    41. 제7장 참고문헌 ...123
    42. 제8장 첨부서류 ...124
  • 참고문헌

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