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보고서 상세정보

유전자재조합식품 검사법 개발연구-마이크로어레이 검사법 실용화를 위한 검증
Development of Detection Method for Genetically Modified Foods (Validation for practical application of microarray-based method)

  • 사업명

    식품등안전관리

  • 과제명

    유전자재조합식품 검사법 개발연구 - 마이크로어레이 검사법 실용화를 위한 검증

  • 주관연구기관

    경희대학교
    Kyung Hee University

  • 연구책임자

    김해영

  • 참여연구자

    김태운   김재환   선설희   김수연   김성언   서영주  

  • 보고서유형

    최종보고서

  • 발행국가

    대한민국

  • 언어

    한국어

  • 발행년월

    2008-12

  • 과제시작년도

    2008

  • 주관부처

    식품의약품안전청

  • 사업 관리 기관

    식품의약품안전청
    Korea Food & Drug Administration

  • 등록번호

    TRKO201000014860

  • 과제고유번호

    1475004048

  • 키워드

    유전자재조합식품.디엔에이칩.마이크로어레이.실용화.검증.Genetically modified food.DNA chip.Microarray.Application.Validation.

  • DB 구축일자

    2013-04-18

  • 초록 


    To validate the microarray detection method, the processed foods of seventy-five soybean and thirty-seven maize were purchased fr...

    To validate the microarray detection method, the processed foods of seventy-five soybean and thirty-seven maize were purchased from markets in Korea and USA. Two GM soybeans (RRS and A2704-12) and thirteen GM maizes (Bt176, Bt11, MON810, MON863, NK603, GA21, T25, TC1507, Bt10, DAS-59122-7, TC6275, MIR604, and LY038) were targeted.
    In order to examine whether or not microarray method is applicable to processed foods, PCR and microarray were separately performed using 112 processed foods. Firstly, lectin (soybean endogenous gene), SSIIb (maize endogenous gene), and GMO screening elements (35S promoter, nos terminator) were targeted. Secondly, samples containing GMO screening elements, whether or not they contain GMO, were tested using PCR and microarray. As a result, 11 soy processed foods (sample no. 16, 21, 34, 55, 58, 90, 103, 114, A1, A5, and A6) contained GM soybean (RRS) and 11 maize processed foods (sample no. 8, 9, 11, 15, 39, 43, 79, B3, B5, B6, and B7) contained 1 to 8 GM maizes.
    In the above microarray analysis, the single PCR based-microarray was used. Consequently, the results of the single PCR based-microarray were equal to the results of PCR. Although the single PCR based-microarray is applicable to processed foods, many times and efforts are required as shown in this study. Therefore, we performed the multiplex PCR-based microarray analysis to improve this problem. The limit of detection (LOD) from the multiplex PCR-based microarray was measured using GM reference materials (100, 10, 5, 3, 1, 0.5, and 0.1%) mixing RRS genomic DNAs with A2704-12 genomic DNA. The LOD value was 1% for GM reference materials (100 ng of mixed genomic DNA as template). To evaluate its practical applicability to processed foods, samples containing RRS were tested using the multiplex PCR-based microarray. In this result, only two of eleven samples containing RRS were positive. This result may be due to GMO quantity in samples.
    For simultaneous analysis of 13 events of GM maize, 4 arrays (array 1: SSIIb, 35S promoter, nos terminator, MON863, TC1507, and MIR604; array 2: Bt176, MON810, NK603, and GA21; array 3: Bt10, DAS-59122-7, TC6275, and LY038; array 4: Bt11 and T25) were used. The limit of detection (LOD) from the multiplex PCR-based microarray was measured using GM reference materials (100, 10, 5, 3, 1, 0.5, and 0.1%) mixed each GM maize genomic DNA for 4 arrays. The LOD value was 1% for GM reference materials (100 ng of mixed genomic DNA as template). To evaluate its practical applicability to processed foods, samples containing GM maize were tested using the multiplex PCR-based microarray. In this result, eleven samples containing GM maize were used and all positive.
    We think that the multiplex PCR-based microarray are not applicable for detection of the GMO content below 1%. However, in consideration with the labeling threshold level (3%) in Korea, this system may be applicable to detect GMO from processed foods.


    본 연구에서는 국내 GMO 표시대상품목들을 대상으로 75개의 콩 가공식품, 37개의 옥수수 가공식품을 국내, 국외에서 수거하여 2007년에 기 개발된 microarray 분석법을 이용하여 실제 가공 식품에 적용 가능성이 있는지에 대...

    본 연구에서는 국내 GMO 표시대상품목들을 대상으로 75개의 콩 가공식품, 37개의 옥수수 가공식품을 국내, 국외에서 수거하여 2007년에 기 개발된 microarray 분석법을 이용하여 실제 가공 식품에 적용 가능성이 있는지에 대한 검증실험을 실시하였다.
    전체적인 실험 절차는 PCR과 microarray를 이용하여 GM 콩 2종과 GM 옥수수 13종을 대상으로 전체 112개의 가공식품에 대해 콩과 옥수수의 내재유전자 및 GMO screening elements(35S promoter, nos terminator) 확인실험을 먼저 실시한 후, GMO screening elements를 하나라도 포함하고 있는 sample들에 대해 GMO 혼입여부를 확인하는 과정으로 진행되었다.
    PCR 분석 결과에서는 75개 콩 가공식품들 중에 11개의 sample(sample no. 16, 21, 34, 55, 58, 90, 103, 114, A1, A5, A6)들이 GM 콩(RRS)를 포함하는 것으로 확인되었고, 37개 옥수수 가공식품들 중에서 11개의 sample(sample no. 8, 9, 11, 15, 39, 43, 79, B3, B5, B6, B7)들이 1-8종의 GM 옥수수를 포함하는 것으로 확인하였다.
    Microarray 분석은 앞의 PCR 분석 결과와 비교가 용이하도록 single PCR-based microarray로 진행되었다. 먼저, 내재유전자, 35S promoter, nos terminator에 대한 각각의 PCR 산물을 3개의 microarray에 개별적으로 hybridization시켜 확인하였다. 이후 실험절차를 간소화하기 위해 이러한 PCR 산물을 혼합한 후 하나의 microarray에 hybridization시켜 확인해 보았으며 두 방법의 결과가 동일하게 나타났다. 따라서 GMO screening elements를 포함하고 있는 것으로 확인된 콩, 옥수수 가공식품에 대한 microarray 분석에서는 GM 콩 2종을 하나의 microarray에서 동시에 확인하고, GM 옥수수 13종을 각각 6종과 7종으로 나누어 2개의 microarray에서 확인함으로써 실험절차를 간소화하였다.
    결론적으로 PCR 분석과 microarray 분석 결과가 모두 동일한 것으로 확인되었다. 그러나 상기에서 적용한 microarray 분석법은 single based-microarray을 이용한 것으로써 정확한 GMO 분석은 가능하지만 많은 수의 GMO를 분석하는데 시간과 노력이 많이 요구된다.
    따라서 본 연구에서는 보다 더 효율적인 microarray 분석을 위해 multiplex PCR-based microarray의 적용 가능성을 확인하였다. 이러한 multiplex PCR-based microarray는 원하는 target DNA를 multiplex PCR를 통해 얻음으로써 많은 수의 GMO를 신속하게 분석할 수 있는 장점이 있다.
    본 연구에서는 GM 콩(RRS)이 혼입된 것으로 확인된 콩 가공식품을 대상으로 실험하였다. 먼저, RRS와 A2704-12가 동일한 DNA 농도(각각 50 ng)로 혼합된 표준시료(100, 10, 5, 3, 1, 0.5, 0.1%)를 준비하였다. 이러한 %별 표준시료를 대상으로 콩의 내재유전자(lectin), GMO screening elements(35S promoter, nos terminator), RRS 및 A2704-12를 동시에 확인할 수 있는 multiplex PCR-based microarray를 실시하였으며 그 결과 검정한계치(limit of detection)가 1%인 것으로 확인되었다. 이러한 multiplex PCR-based microarray를 실제 콩 가공식품에 적용한 결과 앞선 PCR과 single based-microarray 분석 결과에서 RRS를 포함하고 있는 것으로 확인된 11개의 sample 중에 단 2개의 sample들에서만 RRS가 검출되었다. 이것은 각각의 sample에 혼입되어 있는 RRS의 % 함량에 기인한 것으로 판단된다. 옥수수 분석의 경우 13종의 GM 옥수수를 4개의 array(array 1: SSIIb, 35S promoter, nos terminator, MON863, TC1507, MIR604; array 2: Bt176, MON810, NK603, GA21; array 3: Bt10, DAS-59122-7, TC6275, LY038; array 4: Bt11, T25)에 나눠 분석할 수 있도록 설계하였다. 이들 각각의 GM 옥수수를 동일한 DNA 농도(각각 50 ng)
    로 혼합된 표준시료(100, 10, 5, 3, 1, 0.5, 0.1%)를 준비하여 multiplex PCR-based microarray를 실시하였으며 그 결과 검정한계치가 1%인 것으로 확인되었다. 이러한 multiplex PCR-based microarray를 실제 옥수수 가공식품에 적용하였다. 앞선 PCR과 single based-microarray 분석 결과에서 GM 옥수수가 혼입된 11개의 sample들을 대상으로 실험하여, 11개 sample 모두 몇몇 GM 옥수수가 혼입되어 있음이 확인되었다. 결론적으로 현재 국내 GMO 비의도적혼입허용치가 3%인 점을 감안할 때 이러한 multiplex PCR-based microarray를 실제 콩과 옥수수 가공식품 분석에 적용할 수 있을 것으로 판단된다.


  • 목차(Contents) 

    1. 용역연구개발과제 최종보고서 ...1
    2. 제출문 ...2
    3. 목차 ...3
    4. I. 연구개발결과 요약문 ...4
    5. 최종보고서 요약문 ...4
    6. Summary ...7
    7. II. 총괄연구개발과제 연구결과 ...10
    8. 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...10...
    1. 용역연구개발과제 최종보고서 ...1
    2. 제출문 ...2
    3. 목차 ...3
    4. I. 연구개발결과 요약문 ...4
    5. 최종보고서 요약문 ...4
    6. Summary ...7
    7. II. 총괄연구개발과제 연구결과 ...10
    8. 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...10
    9. 1.1 총괄연구개발과제의 목표 ...10
    10. 1.2 총괄연구개발과제의 목표달성도 ...10
    11. 1.3 국내.외 기술개발 현황 ...10
    12. 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ...13
    13. 2.1 GMO 표시제 대상 27개 식품 수거 ...13
    14. 2.2. 원료 및 가공식품으로부터 genomic DNA 추출 ...14
    15. 2.3. 본 연구에 사용될 primers와 probes 제작 ...15
    16. 2.4. 기 개발된 microarray 제작 및 재현성 실험 ...19
    17. 2.5. Microarray를 이용한 가공식품들의 GMO 분석 ...21
    18. 2.6. 가공식품 유형별 검사 감도 등 적용상의 문제점 분석 및 개선 보완 ...23
    19. 제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...24
    20. 3.1. GMO 표시제 대상 27개 식품 수거 ...24
    21. 3.2. 콩 가공식품에 대한 PCR 분석 ...26
    22. 3.3. GMO screening elements(35S promoter, nos terminator)가 확인된 콩 가공식품에 대한 GMO 분석 ...30
    23. 3.4. 옥수수 가공식품에 대한 PCR 분석 ...32
    24. 3.5. GMO screening elements(35S promoter, nos terminator)가 확인된 옥수수 가공식품에 대한 GMO 분석 ...34
    25. 3.6. 콩과 옥수수 가공식품에 대한 Microarray 분석 결과 ...36
    26. 3.7. Probes의 특이성 및 민감도 확인 실험 ...58
    27. 3.8 콩과 옥수수 가공식품에 multiplex PCR-based microarray 적용 실험 ...60
    28. 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...67
    29. 제5장 총괄연구개발과제의 연구성과 ...69
    30. 5.1 활용성과 ...69
    31. 5.2 활용계획 ...70
    32. 제6장 기타 주요변경사항 ...71
    33. 제7장 참고문헌 ...72
  • 참고문헌

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