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인간 재조합 당단백질의 발현시스템 별 비정상적 당질 위험인자 분석 및 평가 기반 구축
Analysis and Evaluation Protocols of Non-Human Glycoepitopes in Human Recombinant Glycoproteins Expressed from Varying Expression Systems

  • 사업명

    생물생명공학의약품안전관리

  • 과제명

    인간 재조합 당단백질의 발현시스템 별 비정상적 당질 위험인자 분석 및 평가기반 구축

  • 주관연구기관

    가톨릭대학교
    Catholic University of Korea

  • 연구책임자

    박용일

  • 참여연구자

    이윤희   이새미   김수현   이지원   이경복   황수경  

  • 보고서유형

    최종보고서

  • 발행국가

    대한민국

  • 언어

    한국어

  • 발행년월

    2008-11

  • 과제시작년도

    2008

  • 주관부처

    식품의약품안전청

  • 사업 관리 기관

    식품의약품안전청
    Korea Food & Drug Administration

  • 등록번호

    TRKO201000014877

  • 과제고유번호

    1475003731

  • 키워드

    당단백질 의약품.비정상 당질구조.고감도 분석.Glycoprotein pharmaceuticals.Unhumanized glycan structure.High sensitivity analysis.

  • DB 구축일자

    2013-04-18

  • 초록 


    - This study was performed to prepare and establish efficient, sensitive, and generalized protocols (SOP) for evaluating the qual...

    - This study was performed to prepare and establish efficient, sensitive, and generalized protocols (SOP) for evaluating the quality and safety of recombinant human glycoprotein therapeutics byanalyzing, especially, the non-human glycan epitopes that could evoke unwanted side effects such as immune reactions when administered to human body as a drug. When expressed in non-human expression systems, such as CHO, Yeast, plants, and insects, human recombinant glycoproteins can have non-human glycan epitopes on their glycan chains due to the diverse and different nature of glycan biosynthesis of these organisms. For this purpose, during the 1st year of research we prepared and established SOPs for monosaccharide analysis required for the glycan chain structure analysis and in the 2nd year of research, we performed non-human glycan epitopes on the recombinant (also native proteins in some cases) human glycoproteins from varying expression systems (CHO, Yeast, plants, insect) and prepared SOPs thereby.
    [1st year]
    ○ Prepared SOPs for monosaccharide analysis of N- & O-glycans in recombinant glycoproteins.
    ○ Prepared SOPs for non-human sialic acid (Neu5Gc) on the recombinant glycoproteins.
    [2nd year]
    ○ Established SOPs for the analysis of non-human glycoepitopes on the recombinant human glycoproteins expressed from varying expression systems (CHO, Yeast, plants, insect).
    < 1st year experimentals and results >
    ○ Prepared SOPs for more sensitive and generalized methods by comparing PMP-labeling/UV HPLC method with HPAEC/PAD (Bio-LC) method using standard monosaccharids,
    ○ Prepared SOPs for monosaccharide analysis of N- & O-glycans by PMP-labeling/UV HPLC.
    ○ Optimized the release of N- & O-glycans from proteins.
    ○ Prepared SOPs for efficient sample pre-treatment and monosaccharide analysis of N- & O-glycans by HPAEC-PAD.
    ○ Prepared SOPs for sensitive qualitative and quantitative analysis of sialic acids (Neu5Ac, Neu5Gc).
    < 2nd year experimentals and results >
    ○ Detection and analysis of non-human glycoepitopes on recombinant human glycoproteins from CHO cells and Yeast.
    ○ Detection of Man$\alpha$1-3Man structure on the N-glycans of recombinant and native proteins from Yeast by enzyme array/HPLC analysis.
    ○ Detection and analysis of sialic acids (Neu5Ac, Neu5Gc), terminal GlcNAc, and Gal$\alpha$1-3Gal on N-glycans of recombinant proteins from CHO cells by enzyme array/HPLC analysis.
    ○ Purification of native and/or recombinant glycoproteins from plants and insect and analysis of Fuc$\alpha$1-3GlcNAc and Xyl$\beta$1-2Man structures (for plants) and Fuc$\alpha$1-3GlcNAc (for insect) on the N-glycans by enzyme array/HPLC analysis.


    본 연구에서는 인간 재조합 당단백질의 발현시스템별 구조적 다양성으로 인해 생성되어 부작용의 원인이 될 수 있는 비정상 당질구조를 효과적이고 고감도로 분석할 수 있는 일반적인 분석법을 제시함으로서 향 후 국가적 차원에서의 재조합 당단...

    본 연구에서는 인간 재조합 당단백질의 발현시스템별 구조적 다양성으로 인해 생성되어 부작용의 원인이 될 수 있는 비정상 당질구조를 효과적이고 고감도로 분석할 수 있는 일반적인 분석법을 제시함으로서 향 후 국가적 차원에서의 재조합 당단백질 의약품의 평가를 위한 당질 구조 (특히, 비정상적 당질 구조)의 일반적인 표준 분석 시안을 확립하고자 하였음. 이를 위해 1차년도에는 당질구조분석의 기초가 되는 성분당 분석법들에 대한 표준 시안을 확립하고, 2차년도에는 실제 발현 시스템 별 (동물, 효모, 식물, 곤충) 발현 재조합 당단백질에 있을 수 있는 비정상 당질구조 분석을 수행하고 분석 시안을 마련 하였음.
    [1차년도]
    ○재조합 당당백질의 N-glycan & O-glycan 성분당의 고감도 분석기반 확립하였음.
    ○재조합 당단백질의 정상 및 비정상 sialic acid 분석 기반 확립하였음.
    [2차년도]
    ○ 발현시스템 별 재조합 당단백질의 비정상 당질 위험인자 구조분석 기반 확립하였음.
    < 1차년도 세부 연구내용 및 결과 >
    ○ 표준당에 대한 PMP 유도체화/UV 분석법 및 HPAEC/PAD법과의 분석 감도 비교 및 고감도 분석법 을 확립하였음.
    ○ PMP 표식/UV 분석법을 이용한 N-glycan & O-glycan 성분당의 고감도 분석.
    ○ 당단백질로부터의 N- 및 O-glycan의 분리 방법 최적화
    ○ 효율적인 시료 전처리 및 HPAEC-PAD 분석에 의한 성분당의 고감도 분석기술 확립
    ○ Sialic acid (Neu5Ac, Neu5Gc)의 고감도 정성, 정량분석 기반 확립
    < 2차년도 세부 연구내용 및 결과 >
    ○ 동물 및 효모 발현시스템 별 인간 재조합당단백질의 비정상 당질 구조 유무 및 구조분석
    ○ N-glycans의 2-AB 형광표식, 효소분해 (Enzyme array)/HPLC 분석을 통해 효모 발현 천연 및 재조합 당단백질로부터 Man?1-3Man구조를 확인하였음.
    ○ N-glycans의 2-AB 형광표식, 효소분해/HPLC 분석을 통해 동물 세포 발현 당단백질로부터 Neu5Ac 및 비정상 sialic acid (Neu5Gc), Terminal GlcNAc 유무, Gal$\alpha$1-3Gal 구조를 확인하였음.
    ○ 2-AB 표지/enzyme array법에 의한 고감도 당사슬 구조 분석법을 확립하였음.
    ○ 식물 유래 천연 당단백질의 Fuc$\alpha$1-3GlcNAc, Xyl$\alpha$1-2Man 구조 확인 및 곤충유래 천연 당단백질과 인간 재조합 당단백질에서 Fuc$\alpha$1-3GlcNAc 구조와 당사슬 구조를 분석하였음.
    ○ 각 발현시스템 별 재조합 당단백질의 비정상 당질 위험인자 구조분석 기반을 확립하였으며, 각각에 대한 SOP를 작성하였음.


  • 목차(Contents) 

    1. 용역연구개발과제 최종보고서 ...1
    2. 표지 ...2
    3. 제출문 ...4
    4. 목차 ...5
    5. I. 연구개발결과 요약문 ...7
    6. 최종보고서 요약문 ...7
    7. Summary ...9
    8. II. 총괄연구개발과제 연구결과 ...11
    9. 제1장 총괄연구개발과제의 최종 ...
    1. 용역연구개발과제 최종보고서 ...1
    2. 표지 ...2
    3. 제출문 ...4
    4. 목차 ...5
    5. I. 연구개발결과 요약문 ...7
    6. 최종보고서 요약문 ...7
    7. Summary ...9
    8. II. 총괄연구개발과제 연구결과 ...11
    9. 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...11
    10. 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ...28
    11. 제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...32
    12. 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...34
    13. 제5장 총괄연구개발과제의 연구성과 ...41
    14. 제6장 기타 주요변경사항 ...43
    15. 제7장 참고문헌 ...43
    16. 제8장 첨부서류 ...44
    17. III. 제 1 세부연구개발과제 연구결과 ...45
    18. 제1장 1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...46
    19. 제2장 1세부연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ...52
    20. 제3장 1세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...53
    21. 제4장 1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...86
    22. 제5장 제1 세부연구개발과제의 연구성과 ...90
    23. 제6장 기타 주요변경사항 ...91
    24. 제7장 참고문헌 ...92
    25. 제8장 첨부서류 ...93
    26. IV. 제 2 세부연구개발과제 연구결과 ...94
    27. 제1장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...95
    28. 제2장 2세부연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ...98
    29. 제3장 2세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...101
    30. 제4장 2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...153
    31. 제5장 제2 세부연구개발과제의 연구성과 ...156
    32. 제6장 기타 주요변경사항 ...156
    33. 제7장 참고문헌 ...157
    34. 제8장 첨부서류 ...157
  • 참고문헌

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