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보고서 상세정보

채소류 중 간염 A 바이러스, 로타바이러스 검출법 기초 개발 연구
Development of detection methods for hepatitis A virus and rotavirus in vegetables

  • 사업명

    식품등안전관리

  • 과제명

    채소류 중 간염 A 바이러스, 로타바이러스 검출법 기초 개발연구

  • 주관연구기관

    건국대학교 산학협력단

  • 연구책임자

    서건호

  • 참여연구자

    김무상   이중복   송광영   현지연   이재훈   박정연   이정아   한소리  

  • 보고서유형

    최종보고서

  • 발행국가

    대한민국

  • 언어

    한국어

  • 발행년월

    2008-11

  • 과제시작년도

    2008

  • 주관부처

    식품의약품안전청

  • 사업 관리 기관

    식품의약품안전청
    Korea Food & Drug Administration

  • 등록번호

    TRKO201000014885

  • 과제고유번호

    1475003795

  • 키워드

    로타바이러스.간염 A 바이러스.식중독 바이러스.채소류.Rotavirus.Hepatitis A virus.Food borne virus.Vegetables.

  • DB 구축일자

    2013-04-18

  • 초록 


    The viral food-borne disease caused by enteric viruses such as rotaviruses and Hepatitis A virus (HAV) has became one of the sign...

    The viral food-borne disease caused by enteric viruses such as rotaviruses and Hepatitis A virus (HAV) has became one of the significant public health concern. These viruses are contaminated fresh fruit and vegetables and these foods may act as a vehicle. Since only few viral particles may cause disease, detection of low concentration of viruses is crucial for control viral food-borne disease. However, limited methods have been developed for detection of the viruses in foods, and a method that isolate and detect viruses in foods has been not standardized. In this study, different elution and concentration methods were compared for optimization of virus detection procedure.
    Twenty five-gram of samples were artificially inoculated with HAV and rotavirus and processed by the sequential steps of homogenization, elution, concentration, RNA extraction, and real-time RT-PCR or cell culture using FRhk-4 cell and MA-104 cell, respectively. Viruses were extracted from the food surface by two different elution buffers, [100mM Tris-HCl, 50mM glycine, 3% beef extract pH 9.5] and [250mM Threonine, 300mM NaCl pH 9.5]. In addition, an ultrafiltration method was evaluated by comparing with widely used viral concentration methods, PEG precipitation. The FRhk-4 cell infected with viruses recovered from the samples to determine infectivity of the viruses.
    The elution buffer [100mM Tris-HCl, 50mM glycine, 3% beef extract pH 9.5] could extract the virus from samples successfully than [250mM Threonine, 300mM NaCl pH 9.5]. The ultrafiltration method was more rapid and effective to concentrate viruses than PEG precipitation. In addition, in the FRhk-4 cell and MA-104 cell infected with viruses recovered from samples, cytopathic effect was observed at 14 dpi(HAV) or 5-7 dpi (rotavirus). This comparison study would be useful for standardization of optimized viral analysis of vegetables.


    본 과제는 채소류에 오염된 A형간염 바이러스 및 로타 바이러스 최적(탈리·농축) 검출법을 개발 하고 A형간염 바이러스 및 로타 바이러스 세포 배양법 연구 개발함으로써 식품에서 A형간염 바이러스 및 로타 바이러스 최적 검출법 확립을 ...

    본 과제는 채소류에 오염된 A형간염 바이러스 및 로타 바이러스 최적(탈리·농축) 검출법을 개발 하고 A형간염 바이러스 및 로타 바이러스 세포 배양법 연구 개발함으로써 식품에서 A형간염 바이러스 및 로타 바이러스 최적 검출법 확립을 통해 식품공전 바이러스 시험법 개선 기틀 마련 및 식중독 바이러스의 신속 정확한 동정 시스템을 구축하고 로타 바이러스 및 A형 간염 바이러스 식중독 발생 시 원인체 규명을 위한 매뉴얼 확립하는 것을 목표로 한다.
    채소류 중 엽채류인 배추, 상추, 깻잎을 선정하여 바이러스 희석액을 접종하고 바이러스를 접종하지 않은 샘플은 음성 대조군으로 사용하며, 야채를 넣지 않은 탈리 용액에 바이러스만을 첨가하여 양성 대조군으로 사용하였다. 접종된 바이러스를 효과적으로 검출 할 수 있도록 탈리방법과 농축방법을 선정하여 비교하고 세포에 감염 시켜 감염성을 평가하였다. 탈리액 비교를 위하여 100mM Tris-HCl, 50mM glycine, 3% beef extract pH 9.5와 또 다른 탈리 용액인 0.25M Threonine-0.3M NaCl pH 9.5를 준비하였다. 농축방법을 비교하기 위하여 PEG(polyethylene glycol) precipitation (PEG 6000)또는 Ultrafiltration (Nanoceram filter$^{\circledR}$ (Argonide corporation))을 이용하여 농축하였다.
    바이러스의 감염성 평가를 위하여 FRhK-4 cell과 MA-104 cell을 배양하였다. 탈리, 농축 방법을 거쳐 준비된 간염 A 바이러스 샘플과 로타바이러스 샘플을 접종하고 세포병변을 관찰한 후 CPE(cytopathic effect)가 나타나기 시작하는 시점에 RNA를 추출하여 real time RT-PCR을 시행하였다.
    탈리용액 100mM Tris-HCl, 50mM glycine, 3% beef extract pH 9.5과 250mM Threonine, 300mM NaCl pH 9.5을 이용하여 탈리 하였을때 100mM Tris-HCl, 50mM glycine, 3% beef extract pH 9.5이 더 뛰어난 탈리효과를 보였다. 농축방법을 비교했을 때 PEG 침전법과 Ultrafiltration방법 중 Ultrafiltration방법이 농축에 더 효과적임이 나타났다. Ultrafiltration방법이 기존의 PEG 침전법에 비해서 바이러스의 농축에 효과적이며 시간이나 노동력 면에서 효율적이다. FRhK-4 cell과 MA-104 cell에 탈리 농축된 HAV와 rotavirus 접종하였을 때 CPE를 관찰 할 수 있었으며 real-time RT-PCR을 시행함으로써 바이러스 유무를 테스트 할 수 있었다. Integratied RT-PCR을 시행하였을 때 HAV의 경우 240시간(10일)부터 rotavirus의 경우 48시간부터 Ct값이 감소하기 시작하였고 CPE 또한 나타나기 시작했다. 본 연구에서 선정된 탈리 용액 (100mM Tris-HCl, 50mM glycine, 3% beef extract pH 9.5)은 참고논문에서 선정된 탈리 용액으로서 과일과 채소에서 바이러스를 효과적으로 탈리가능하고 pH안전성이 높아 추후에 산도가 높은 과일에도 적용 가능할 것으로 보인다. Ultrafiltration을 이용한 농축법은 기존의 PEG법에 비해 시간과 노동력을 줄일 수 있고 효율 또한 우수한 방법으로서 현재 음식에서 바이러스를 분리하는 데 사용한 연구는 미약한 상태로 회수율을 높이기 위한 연구가 계속되어야 할 것으로 여겨진다. 그리고 세포접종을 이용한 감염성 평가는 CPE로 평가하기에는 장시간이 소요되므로 integrated/ cell culture RT-PCR을 적극 활용하여 시간 소비를 최소하는 것이 가장 중요할 것이다.
    본 연구의 결과물은 실험실 조건에서 사용되는 바이러스를 시료에 인위적으로 감염, 탈리, 농축 등의 방법으로 진행되었기 때문에 자연계에서 수거된 검체로부터 본 연구 결과를 적용하기 위해서는 자연계에 존재하는 다양한 인자에 대한 검토가 수반되어 적용되어야 할 것으로 사료된다.


  • 목차(Contents) 

    1. 용역연구개발과제 최종보고서 ...1
    2. 제출문 ...2
    3. 목차 ...3
    4. I. 연구개발결과 요약문 ...4
    5. 최종보고서 요약문 ...4
    6. Summary ...6
    7. II. 총괄연구개발과제 연구결과 ...8
    8. 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...8...
    1. 용역연구개발과제 최종보고서 ...1
    2. 제출문 ...2
    3. 목차 ...3
    4. I. 연구개발결과 요약문 ...4
    5. 최종보고서 요약문 ...4
    6. Summary ...6
    7. II. 총괄연구개발과제 연구결과 ...8
    8. 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...8
    9. 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ...24
    10. 제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...29
    11. 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...38
    12. 제5장 총괄연구개발과제의 연구성과 ...42
    13. 제6장 기타 주요변경사항 ...44
    14. 제7장 참고문헌 ...45
    15. 제8장 첨부서류 ...46
    16. III. 제 1 세부연구개발과제 연구결과 ...47
    17. 제1장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...48
    18. 제2장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ...55
    19. 제3장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...61
    20. 제4장 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...74
    21. 제5장 제1세부연구개발과제의 연구성과 ...80
    22. 제6장 기타 주요변경사항 ...82
    23. 제7장 참고문헌 ...83
    24. 제8장 첨부서류 ...84
    25. IV. 제 2 세부연구개발과제 연구결과 ...85
    26. 제1장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...86
    27. 제2장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ...96
    28. 제3장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...101
    29. 제4장 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...116
    30. 제5장 제2 세부연구개발과제의 연구성과 ...122
    31. 제6장 기타 주요변경사항 ...124
    32. 제7장 참고문헌 ...125
    33. 제8장 첨부서류 ...126
  • 참고문헌

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