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세포의 형질전환을 지표로 하는 유전독성시험법의 개발연구
Development of testing method using cell transformation as the indicator of genotoxicity

  • 사업명

    안전성관리기반연구

  • 과제명

    세포의 형질질환을 지표로 하는 유전독성시험법의 개발 연구

  • 주관연구기관

    인천대학교 산학협력단

  • 연구책임자

    이미가엘

  • 참여연구자

    김지영   이건우   안준호   엄기환   남미연  

  • 보고서유형

    최종보고서

  • 발행국가

    대한민국

  • 언어

    한국어

  • 발행년월

    2008-04

  • 과제시작년도

    2007

  • 주관부처

    식품의약품안전청

  • 사업 관리 기관

    식품의약품안전청
    Korea Food & Drug Administration

  • 등록번호

    TRKO201000015018

  • 과제고유번호

    1475003489

  • 키워드

    유전독성.발암성.세포형질전환시험법.독성예측.Genotoxicity.Carcinogenicity.In vitro cell transformation assay.Toxicity prediction.

  • DB 구축일자

    2013-04-18

  • 초록 


    Non-genotoxic carcinogens, which exert their effect on cells through mechanism devoid of direct interaction with DNA, were found ...

    Non-genotoxic carcinogens, which exert their effect on cells through mechanism devoid of direct interaction with DNA, were found to be negative in a variety of genotoxicity assays. The in vitro cell transformation assay (CTA) has been proposed to identify possible noncarcinogenic carcinogens in addition to genotoxic carcinogens. Thus, in this study, the in vitro cell transformation assays were performed using BALB/c 3T3 murine fibroblasts and HaCaT human keratinocytes in order to evaluate concordance between both in vitro CTAs and carcinogenicity with six test articles differing in their genotoxic and carcinogenic potential. We concluded that, of the 6 chemicals tested, the sensitivity for BALB/c 3T3 system was reasonably high, being 100%. The respective specificity for BALB/c 3T3 assay was 50%. We also investigated the correlation between results of BALB/c 3T3 assay and results from HaCaT assay in order to develop a reliable human cell transformation assay. However, evaluation of staining at later time points beyond the confluency stage did not yield further assessable data because most of HaCaT cells were detached after 2-3 days of confluency. Thus, after test article treatment, HaCaT cells were split before massive cell death began. In this modified protocol for this HaCaT system, growing attached colonies were counted instead of transformed foci 3 weeks since last subculture. Compared to BALB/c 3T3 assay, HaCaT assay showed moderate low sensitivity and high specificity. Despite these differences in specificity and sensitivity, both cell systems did exhibit same good concordance between in vitro CTA and rodent carcinogenicity findings (overall 83% concordant results). In addition, this study also showed the possibility that HaCaT cell could be transformed by the continuous culture using collagen-coated plates instead of subculture. Further to improve the sensitivity to carcinogens and to shorten experimental period, wt-Raf-transfected cells was used to establish in vitro cell transformation assay. Finally, the ability of paclitaxel, an anticancer agent, to induce cell transformation was measured with in vitro cell transformation assay using BALB/c 3T3 cells. We found that paclitaxel has little cell-transforming activity.


    유전자 손상을 측정하는 전통적 개념의 유전독성 시험은 발암의 다양한 기작에도 불구하고 전통적인 유전독성시험의 경우 주로 DNA에 손상을 주는 지의 여부를 평가하는 방법에 치우쳐 있기 때문에 정확한 발암성을 확인하기에는 많은 문제가 ...

    유전자 손상을 측정하는 전통적 개념의 유전독성 시험은 발암의 다양한 기작에도 불구하고 전통적인 유전독성시험의 경우 주로 DNA에 손상을 주는 지의 여부를 평가하는 방법에 치우쳐 있기 때문에 정확한 발암성을 확인하기에는 많은 문제가 있다. 따라서, 정확한 발암성의 판단을 위해서는 단순한 유전독성여부의 평가에 치우치지 않고 실제 세포의 형질전환능력에 평가가 가능한 시험법에 대한 필요성이 대두되었다. 본 연구에서는 마우스 유래 BALB/c 3T3 세포주와 인간 유래 HaCaT 세포주, 그리고 wt-Raf-transfected BALB/c 3T3 세포주에서 유전독성 및 발암성을 기준으로 선정된 물질에 대한 형질전환여부의 분석을 통하여 시험법에 대한 표준작업지침서를 작성하고, 동물을 사용하는 발암성과의 비교분석을 통하여 발암성의 예측 가능성 판단에 사용하고자 하였다. in vitro cell transformation (CTA) 시험법 확립과 검증을 위해서는 유전독성 및 발암성 결과가 알려진 유전독성 발암물질 6종을 선정하여 murine BALB/c 3T3 세포주를 사용하여 시험법을 확립하였다. BALB/c 3T3 세포주를 이용한 실험결과에서는 genotoxic non-carcinogen 중 benzyl alcohol이 처리 최고농도에서 양성으로 나타난 것을 제외하면 기존의 발암성결과와 동일한 판정결과를 보여주었다. 하지만, HaCaT 인간세포주의 경우, 세포가 바닥에서 떨어짐으로 기존의 방법으로는 형질전환시험이 불가능 하였기 때문에 시험물질 처리 2주 및 3주째 계대배양을 해주고, 마지막 계대배양 3주후 형질전환된 foci 측정대신 배양접시 바닥에 붙어자라는 콜로니의 수를 계수하였다. 이러한 방법으로 판정된 실험 결과는 발암성 예측면에서 마우스세포주에서 나타난 결과와 동일한 concordance를 가지는 것으로 나타났다. 더불어 HaCaT 세포주에서 collagen-coated plates 사용시 계대배양없이도 6주간의 배양을 통하여 형질전환되는 foci를 얻을 수 있는 가능성을 발견하였다. 또한, 일반적인 형질전환시험의 경우 시험기간이 6주정도로 긴 기간이 소요되는 관계로 proto-oncogene의 일종인 wt-Raf 유전자를 transfection 시켜서 발암개시 단계에서 외부 물질에 대한 감수성을 증가시킨 세포주를 사용하여 CTA 실험을 수행하였다. 마지막으로 긴급한 사용목적으로 인하여 일반적으로 발암성시험이 유예되는 항암제에 대한 세포형질전환능력에 대한 연구를 위해서 유방암치료제로 널리 사용되는 paclitaxel에 대한 CTA시험을 수행하여 발암 유발가능성이 매우 낮음을 확인하였다.


  • 목차(Contents) 

    1. 용역연구사업 연구결과보고서 ...1
    2. 제출문 ...2
    3. 목차 ...3
    4. I. 연구개발결과 요약문 ...4
    5. 연구결과보고서 요약문 ...4
    6. Summary ...6
    7. II. 총괄연구개발과제 연구결과 ...8
    8. 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...8...
    1. 용역연구사업 연구결과보고서 ...1
    2. 제출문 ...2
    3. 목차 ...3
    4. I. 연구개발결과 요약문 ...4
    5. 연구결과보고서 요약문 ...4
    6. Summary ...6
    7. II. 총괄연구개발과제 연구결과 ...8
    8. 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...8
    9. 1.1 총괄연구과제의 목표 ...8
    10. 1.2 총괄연구과제의 목표달성도 ...10
    11. 1.3 국내.외 기술개발 현황 ...11
    12. 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ...17
    13. 2.1 연구개발 내용 ...17
    14. 2.2 연구개발 방법 ...18
    15. 제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...26
    16. 3.1 마우스 세포주를 이용한 형질전환시험법 확립 ...26
    17. 3.2 인간 세포주를 이용한 CTA 시험법 확립 및 마우스 세포주와의 종간 차이성 비교 ...34
    18. 3.3 wt-Raf-transfected BALB/c 3T3 cell을 이용한 형질전환시험법의 확립 ...53
    19. 3.4 BALB/c 3T3 세포를 이용한 paclitaxel에 대한 형질전환시험 ...57
    20. 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...60
    21. 4.1 연구 결과 고찰 ...60
    22. 4.2 결론 ...62
    23. 제5장 총괄연구개발과제의 연구성과 ...63
    24. 5.1 활용성과 ...63
    25. 5.2 활용계획 ...64
    26. 제7장 기타 중요변경사항 ...65
    27. 제7장 참고문헌 ...65
    28. 제8장 첨부서류 ...67
    29. 8.1 게재논문 사본 ...67
    30. 8.2 세포를 이용한 형질전환시험법에 대한 표준작업지침서 (SOP) ...75
  • 참고문헌

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