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보고서 상세정보

한약재의 생리활성성분 분리 및 효능유전자 확인 연구; 천궁, 음양곽
Study on the Isolation of Bioactive Components and the Identification of Biomarker Genes from Oriental Herbal Medicines (Project 4: Epimedium koreanum Nakai and Cnidium officinale Makino)

  • 사업명

    독성연구개발

  • 과제명

    한약재의 생리활성성분 분리 및 효능유전자 확인 연구(음양곽, 천궁)

  • 주관연구기관

    고려대학교 산학협력단

  • 연구책임자

    박영인

  • 보고서유형

    최종보고서

  • 발행국가

    대한민국

  • 언어

    한국어

  • 발행년월

    2006-11

  • 과제시작년도

    2006

  • 주관부처

    식품의약품안전청

  • 사업 관리 기관

    식품의약품안전청
    Korea Food & Drug Administration

  • 등록번호

    TRKO201000015110

  • 과제고유번호

    1470001540

  • 키워드

    음양곽.천궁.천연물질 분리.HPLC와 LC/MS 동시 분석법.효능 유전자.Epimedium koreanum.Cnidium officinale.isolation of natural compounds.HPLC-LC/MS simultaneous analysis.DNA microarray.biological marker gene.

  • DB 구축일자

    2013-04-18

  • 초록 


    ○ For the standardization of herbal medicine, the isolation of bioactive compound, the development of HPLC and LC/MS based simult...

    ○ For the standardization of herbal medicine, the isolation of bioactive compound, the development of HPLC and LC/MS based simultaneous analysis method and identification of biomarker genes from Epimedium koreanum Nakai and Cnidium officinale Makino were carried out in this project.
    ○ Fifteen compounds were isolated from the 70% methanol extract of Epimedii herba by column chromatography. Among them, 12 compounds were identified the chemical structures as icariin, hyperoside, chlorogenic acid, epimedin A, epimedin B, epimedin C, hexandraside E, epimedoside F, epimedoside A, 2''-O-Rhamnosylicariside II, icariside II and quercetin.
    ○ Eight compounds, which are Z-ligustilide, Z-Butylidenephthalide, Neocnidilide, Senkyunolide A, Ferulic acid, Chlorogenic acid, Oleanolic acid, $\beta$-Sitosterol, Pregnenolone, Levistolide A, were purified from the 70% methanol extract of Cnidii Rhizoma. And one more compound was isolated and is under the elucidation of the chemical structure.
    ○ A sensitive and rapid LC/MS/MS and HPLC methods have been developed and validated for the quantitative determination of 5 compounds (hyperoside, epimedin A, epimedin B, epimedin C and icariin) which are main components of 70% ethanol extract of Epimedii herba. 70% ethanol extracts of Epimedii herba which cultivated from several different place, were analyzed their contents. For the chemical fingerprinting of Cnidium officinale Makino, A LC/MS/MS and HPLC based methods has been developed and validated for the simultaneous determination of chlorogenic acid, ferulic acid, senkyunolide A, (Z)-ligustilide, which are major components of Cnidii Rhizoma. 70% ethanol extracts of Cnidii Rhizoma which cultivated from several different place, were determined the contents of these five components.
    ○ After the determination of each components of Epimedii herba or Cnidii Rhizoma using HPLC/UV/MS, database were created using the retention time, m/z value and UV absorption area of each peak and the ratio of mass intensity to each peak. Total ion chrompatogram which were obtained from the analysis of the 70% ethanol extracts from several batches of Epimedii herba and Cnidii Rhizoma using LC/MS, were applied to the database, analyzed their major components and determined the similarity of each sample by similarity index.
    ○ To observe the change of the gene expression profile by Epimedii herba and its components, icariin, epimedin B and hyperoside, LNCaP cell line were selected by the observation of gene expression change of the male sex function related genes. SK-N-SH cell line were used for the determination of gene expression profile by the Cnidii Rhizoma related to antisedative effect. Cnidiin Rhizoma extract and its effective components, ligustilide, Senkyunolide A 및 ferulic acid, were inhibited the NO production induced by NMDA which is a CNS stimulating toxicant.
    ○ For the DNA microarray experiments, ABI Full Genome Expression Human Microarray was used and array data was filtered using the criteria of signal/noise ratio > 3 (50% samples), flag < 100 and normalized using Quantile method. Then DEG analysis was carried out to select the significant genes which were significantly changed more than 2 fold the expression by the herbal extract or their components (P<0.05). Significant genes were analyzed using the gene clustering and biological signal pathway. From significant genes, over 20 known genes per each extract or component were selected and validated using realtime PCR.
    ○ DNA microarray data from the 70% ethanol extract of Epimedii herba and Cnidii Rhizoma and their components were provided to the database team to create the database for the biomarker genes of herbal medicine.


    ○ 본 과제는 한약재의 과학화를 위한 천궁과 음양곽의 생리활성 성분 분리, 분석법 확립 및 유전자칩을 이용한 효능유전자의 database 구축을 최종목표로 하였다.
    ○ 음양곽을 70% methanol로 추출하여 CHCl3, E...

    ○ 본 과제는 한약재의 과학화를 위한 천궁과 음양곽의 생리활성 성분 분리, 분석법 확립 및 유전자칩을 이용한 효능유전자의 database 구축을 최종목표로 하였다.
    ○ 음양곽을 70% methanol로 추출하여 CHCl3, EtOAc, n-BuOH 등의 용매분획을 한 것으로부터 Icariin, Hyperoside, Chlorogenic acid, Epimedin A, Epimedin B, Epimedin C, Hexandraside E, Epimedoside F, Epimedoside A, 2''-O-Rhamnosylicariside II, icariside II, 및 quercetin 등 12종의 물질을 분리하여 구조 동정하였으며, 추가적으로 3종의 화합물을 분리하여 구조분석중이다.
    ○ 천궁은 70% methanol로 추출한 후 용매 분획을 실시하고, column chromatography를 통해 Z-ligustilide, Z-Butylidenephthalide, Neocnidilide, Senkyunolide A, Ferulic acid, Chlorogenic acid, Oleanolic acid, $\beta$-Sitosterol, Pregnenolone, Levistolide A 등의 10종의 화합물을 분리 정제하였으며 추가적으로 1종이상의 화합물을 분리, 동정 중이다
    ○ HPLC와 LC/MS/MS를 이용하여 음양곽의 경우, hyperoside, epimedin A, epimedin B, epimedin C, icariin에 대한 동시 분석법을 확립하고 validation을 한 후 실제 음양곽 추출물 시료를 분석하여 이들 화합물의 함량을 분석하였다. 천궁의 경우 chlorogenic acid, ferulic acid, senkyunolide A, (Z)-ligustilide에 대한 동시 분석법을 확립하고 validation을 한 후 실제 천궁 추출물 시료를 분석하여 이들 화합물의 함량을 분석하였다.
    ○ 음양곽 및 천궁의 추출물 시료를 HPLC/UV/MS로 분석한 후 전체 프로파일에 대하여 각 peak의 retention time, m/z 값, UV 흡수 peak 면적, mass intensity에 대한 피크 면적을 정리하여 데이터베이스화하였다. 음양곽 및 천궁의 추출물 시료를 LC/MS로 분석한 후 얻은 total ion chromatogram에 대하여 retention time, m/z 값, mass intensity를 데이터화하여 주성분 분석을 수행하고 각 시료 간 similarity index(SI)값을 구하여 시료간의 유사성을 관찰하였다.
    ○ 음양곽은 남성 성기능과 관련된 효소들의 발현 정도를 실험하여 여러 세포주 중에서 LNCaP 세포주를 선정하였으며, 음양곽의 효능물질로는 nitric oxide 생성 및 성기능과 관련된 효소들의 발현과 함유량 등을 기본으로 icariin과 epimedin B 및 hyperoside 를 선정하였다. 천궁 및 그 분리물질 3종 ligustilide, Senkyunolide A 및 ferulic acid의 진정작용을 신경독성물질인NMDA에 의한 NO 생성 이 저해되는 결과를 바탕으로 천궁의 진정작용을 약리효능으로 DNA chip 실험을 실시하였다.
    ○ DNA microarray 실험은 ABI사의 Full Genome Expression Human Microarray를 사용하였으며, 얻어진 결과는 signal/noise ratio > 3 (50% 시료), flag < 100 인 데이터를 filtering 한 후 normalization 하였다. 그 후 DEG 분석을 실시하여 2배 이상 증가하고, 유의적으로 발현 (P<0.05) 이 변화한 유전자만을 선별하여 clustering 분석 및 유전자들의 생물학적 기능 및 관련 biological pathway를 분석하였다. 각 물질로부터 선정한 유의 유전자 중 유전자 기능이 알려진 20개 내외의 유전자를 선정하여 realtime PCR로 DNA microarray와 결과를 검증하였다. 산지별로 천궁 5종을 선정하여 DNA microarray를 실시하여 PCA 및 SI 값을 구하여 시료간의 유사성을 관찰하였다.
    ○ 음양곽과 천궁의 DNA microarray 결과들은 database 분석팀에 제공하여 효능유전자의 database 구축을 하였다.


  • 목차(Contents) 

    1. 용역연구사업 연구결과보고서 ...1
    2. 제출문 ...2
    3. 목차 ...3
    4. I. 연구개발결과 요약문 ...4
    5. 연구결과보고서 요약문 ...4
    6. Summary ...5
    7. II. 총괄연구개발과제 연구결과 ...7
    8. 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...8...
    1. 용역연구사업 연구결과보고서 ...1
    2. 제출문 ...2
    3. 목차 ...3
    4. I. 연구개발결과 요약문 ...4
    5. 연구결과보고서 요약문 ...4
    6. Summary ...5
    7. II. 총괄연구개발과제 연구결과 ...7
    8. 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...8
    9. 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ...17
    10. 제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...40
    11. 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...127
    12. 제5장 총괄연구개발과제의 연구성과 ...132
    13. 제6장 기타 중요 변경사항 ...135
    14. 제7장 참고문헌 ...136
    15. 제8장 첨부서류 ...139
    16. III. 제1세부연구개발과제 연구결과 ...144
    17. 제1장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...145
    18. 제2장 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ...150
    19. 제3장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...170
    20. 제4장 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...231
    21. 제5장 세부연구개발과제의 연구성과 ...234
    22. 제6장 기타 중요 변경사항...235
    23. 제7장 참고문헌 ...236
    24. 제8장 첨부서류 ...238
    25. IV. 제2세부연구개발과제 연구결과 ...243
    26. 제1장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...244
    27. 제2장 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ...249
    28. 제3장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...256
    29. 제4장 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...338
    30. 제5장 세부연구개발과제의 연구성과 ...342
    31. 제6장 기타 중요 변경사항 ...344
    32. 제7장 참고문헌 ...345
    33. 제8장 첨부서류 ...346
  • 참고문헌

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