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보고서 상세정보

생물.생명공학의약품의 세포기질 적합성에 관한 연구
In vitro and in vivo trmorigenicity assay for cell substrate

  • 사업명

    국제협력연구

  • 과제명

    생물,생명공학의약품의 세포기질 적합성에 관한 연구

  • 주관연구기관

    서울대학교 의과대학
    Seoul National University

  • 연구책임자

    박웅양

  • 보고서유형

    최종보고서

  • 발행국가

    대한민국

  • 언어

    한국어

  • 발행년월

    2006-11

  • 과제시작년도

    2006

  • 주관부처

    식품의약품안전청

  • 사업 관리 기관

    식품의약품안전청
    Korea Food & Drug Administration

  • 등록번호

    TRKO201000015112

  • 과제고유번호

    1470001507

  • 키워드

    in vitro 발암성 분석.in vivo 발암성 분석.잔류 DNA.세포기질.Cell substrate.in vitro tumorigenicity assay.residual DNA.in vivo tumorigenicity assay.

  • DB 구축일자

    2013-04-18

  • 초록 


    Any recombinant proteins needs to validate their potential to induce cancers in patients by the contamination of cell substrate a...

    Any recombinant proteins needs to validate their potential to induce cancers in patients by the contamination of cell substrate and/or residual DNAs. To minimize unwanted tumorigenic effect by those cell substrates or residual DNA, the standards for all biologicals using cell substrates are required. In an effort to harmonize the biological standards through WHO, we have established the procedure to detect the tumorigenic potential by cell substrates and residual DNA in the biologicals. In addition, the local standards for the number or cell substrates and the amount of DNA in the biologicals should be proposed to promote public health in Korea.
    The WHO harmonizing project for tumorigenicity covers the development of in vivo and in vitro tumorigenicity assay and the new standards for residual DNA in biologicals. To this end, we used 'soft agar assay' in which the transformed (cancer) cells can be grown without the attachment to the matrix, so called anchorage-independent growth. First, NIH3T3 cells and derivatives like NIH3T3(c-myc), NIH3T3(H-$Ras^{V12}$) and NIH3T3(c-myc+H-$Ras^{V12}$) were used as a negative and positive control for in vitro tumorigenicity assay for cell substrates. We tested 10 human cancer cell lines to validate their tumorigenic potential in terms of anchorage-independent growth. For in vivo tumorigenicity assay for cell substrates, we injected $10^6$~$10^7$ cells/animal into Balb/c-nu mice to monitor the growth of tumor mass. NIH3T3 cells and derivatives were used as a control and Vero, 293T, CHO, HeLa and IMR-90 cells were tested to find that CHO, HeLa, 293T cells could produce tumor mass in vivo.
    Genomic DNAs from cell substrates like Vero, 293T, CHO and HeLa were tested in vitro to check their tumorigenic potential using NIH3T3 cells. While the control plasmid DNA like c-myc and H-$Ras^{V12}$ could induce colonies in soft agar assay, but genomic DNA could not induce the growth of cells even in the presence of single oncogenic plasmid DNA. We used 8ug of genomic DNA per 60mm dish, which ranges $10^4$~$10^5$ of safety margin. Next we injected genomic DNAs from five cell substrates into NZW/N and Balb/c-nu mice to check in vivo tumorigenicity of residual DNAs. While we could not find any tumor mass with genomic DNAs, there were no tumors grown in oncogenic plasmid injected animals even at high dose like 40ug/animal. It might be due to the extremely low efficiency of DNA delivery into cells and relatively short period of observation (10~15 weeks).
    Because in vitro and in vivo tumorigenicity assays require long periods of observation and facility to maintain animals, we need to establish more rapid and efficient monitoring methods to predict the tumorigenic potential based on genomic screening. DNA microarray technology has established high-throughput analysis on molecular profiling of various types of cancers. From gene expression data obtained by microarray, we can investigate diagnostic applications at the molecular levels. Most important step in the application of microarrays to cancer diagnostics is to select the specific markers from the gene expression profiles. To select markers for immortalization (Imm) and transformation (Trf), we used c-myc and Ha-ras oncogene-transfected NIH3T3 cells, respectively. We have identified differentially expressed genes in two models (8751 genes for Imm/Trf) by multivariate permutation F-test (95% confidence, FDR <0.01). Using SVM(Support Vector Model) classification algorithm, we could select and use 17 genes (Imm/Trf) to predict each group with perfect accuracy. We tested H-$Ras^{V12}$-transfected 'transformed' cell to validate Imm/Trf classification. These molecular markers give valuable additional information for tumour diagnosis, prognosis and therapy development.


    생물.생명공학의약품의 제조과정에 사용되는 세포기질 및 잔류 DNA의 발암성을 in vitro 및 in vivo system에서 각각 측정함으로써 잔류허용 기준을 설정하고 바이오마커를 개발함으로써 안전성평가를 위한 시험법을 확립하는 ...

    생물.생명공학의약품의 제조과정에 사용되는 세포기질 및 잔류 DNA의 발암성을 in vitro 및 in vivo system에서 각각 측정함으로써 잔류허용 기준을 설정하고 바이오마커를 개발함으로써 안전성평가를 위한 시험법을 확립하는 것을 연구목표로 하였다.
    이를 위하여 첫째로 세포기질 자체의 발암성을 in vitro에서 분석하였으며, 이를 위하여 NIH3T3 및 c-myc 및 H-$Ras^{V12}$ 암유전자를 발현하는 세포를 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용하여 soft agar assay 법을 구축하였다. Saos-2등 10여개 인체 종양 세포주에 대해 in vitro 발암성을 분석하고 이를 in vivo 발암성 분석 자료와 비교하여 in vitro 발암성 분석이 신속하고 간단하지만 민감성이 in vivo 분석법에 비해 떨어지는 점을 고려하였다.
    세포기질의 잔류 DNA에 의한 암유발 가능성을 in vitro에서 분석하기 위하여 NIH3T3 및 Rat2, MCF10A, HeLa, 293T등 5종의 세포에서 H-$Ras^{V12}$ 와 c-myc에 의한 in vitro 발암성 분석법을 확립하고 암유전자 DNA의 용량별로 분석하여 in vitro 발암성 분석법에 대한 tumor producing dose를 NIH3T3세포에서 <1ug/60mm dish로 정하였다.
    NIH3T3, NIH3T3(c-myc), NIH3T3(H-$Ras^{V12}$), NIH3T3(c-myc+H-$Ras^{V12}$) 등 4종의 세포를 대조군으로 하여 Vero, HeLa, CHO, 293T, IMR90 등 5종의 세포에 대하여 Balb/c-nu 면역결핍 생쥐에서 in vivo 세포기질의 발암성을 분석하여 CHO, 293T 및 HeLa 세포가 in vivo에서 암을 유발하는 것을 확인하였다.
    H-$Ras^{V12}$ 와 c-myc 암유전자를 이용하여 NZW/N 및 Balb/c-nu 등 2종의 생쥐를 대상으로 in vivo 발암성 분석법을 수행하였으나 최대 40ug/animal에서 20주간 관찰로는 종양형성을 볼 수 없었다. Vero, HeLa, CHO, 293T등 4종의 세포에서 추출한 genomic DNA를 생쥐당 100ug씩 NZW/N와 Balb/c-nu 등 2종의 생쥐에 주사하여 in vivo 발암성 분석을 수행하였으나 종양발생을 확인할 수 없었다. Genomic DNA와 함께 c-myc 또는 H-$Ras^{V12}$를 함께 주사한 경우도 두 종류의 생쥐에서 모두 종양발생을 확인할 수 없었다.
    NIH3T3, NIH3T3(c-myc), NIH3T3(H-$Ras^{V12}$), NIH3T3(c-myc+H-$Ras^{V12}$) 등 4종의 세포를 이용하여 47,000개 유전자에 대한 유전자 발현 분석을 microarray를 이용하여 수행하였으며 NIH3T3, NIH3T3(c-myc), NIH3T3(c-myc+H-$Ras^{V12}$) 를 구분할 수 있는 17개 유전자 바이오마커를 발굴하였다. 인체 종양세포주 8종에 대한 47,000개 유전자 발현 분석을 수행하였으며, immortalization, transformation 관련 바이오마커의 발현 양상을 통해 세포기질 발암성 예측 알고리즘을 개발하였다.
    본 과제를 통해서 세포기질 및 잔류 DNA에 대한 in vivo 및 in vitro 발암성 평가방법과 기준을 설정할 수 있었다. 국내 실험조건과 자원을 가지고 생명공학제품 개발에 사용되는 세포기질의 적합성에 대한 평가기준을 자체적으로 설정할 수 있게 되었다. 이러한 기준관련 자료를 기반으로 WHO 및 선진국의 생명공학제재 개발, 특히 세포기질에 대한 기준을 비교 검토하여 수입되는 의약품에 대한 자체 평가 및 수출 의약품에 대한 검증에 중요한 자료로 활용될 수 있을 것이다. 과제 수행과정에서 평가한 세포기질에 대한 자료는 향후 동일한 세포기질에 대한 발암성 평가기준으로 활용될 수 있을 것이며, 실험 방법과 tumor producing dose등에 대한 자료가 기준설정에 유용하게 활용될 수 있을 것이다. 새로운 바이오마커를 개발하기 위하여 세포의 불멸화 및 형질전환과 관련된 유전자 발현 정보를 대규모로 확보하여 DB로 구축하였으며, 이는 유전체 분석연구의 기반이 될 수 있을 것이며, 동시에 바이오마커의 기능연구, 또는 바이오마커 분석을 통한 세포기질의 평가에 활용될 수 있다.


  • 목차(Contents) 

    1. 표지 ...1
    2. 용역연구사업 연구결과보고서 ...2
    3. 제출문 ...3
    4. 목차 ...4
    5. I. 연구개발결과 요약문 ...5
    6. 연구결과보고서요약문 ...5
    7. Summary ...6
    8. II. 총괄연구개발과제 연구결과 ...7
    9. 제1장 총괄연구개발과제의 최종 ...
    1. 표지 ...1
    2. 용역연구사업 연구결과보고서 ...2
    3. 제출문 ...3
    4. 목차 ...4
    5. I. 연구개발결과 요약문 ...5
    6. 연구결과보고서요약문 ...5
    7. Summary ...6
    8. II. 총괄연구개발과제 연구결과 ...7
    9. 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...8
    10. 1.1 총괄연구개발과제의 목표 ...8
    11. 1.2 총괄연구개발과제의 목표달성도 ...10
    12. 1.3 국내.외 기술개발 현황 ...11
    13. 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ...14
    14. 2.1 연구개발 내용 ...14
    15. 2.2 연구방법 ...16
    16. 제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...18
    17. 1. 세포기질에 대한 in vitro 발암성 분석 ...18
    18. 2. 세포기질에 대한 in vivo 발암성 분석 ...21
    19. 3. 세포기질 잔류 DNA의 in vitro 발암성 분석 ...24
    20. 4. 세포기질 잔류 DNA의 in vivo 발암성 분석 ...30
    21. 5. Immortalization 및 transformation 관련 바이오마커 개발 ...32
    22. 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...35
    23. 1. 세포기질에 대한 in vitro 발암성 분석...35
    24. 2. 세포기질에 대한 in vivo 발암성 분석...35
    25. 3. 세포기질 유래 잔류 DNA의 in vitro 발암성 분석...36
    26. 4. 세포기질 유래 잔류 DNA의 in vivo 발암성 분석...36
    27. 5. 새로운 불멸화-형질전환 유전자 바이오마커 개발 및 예측알고리즘...37
    28. 제5장 총괄연구개발과제의 연구성과 ...38
    29. 5.1 활용성과...38
    30. 5.2 활용계획...39
    31. 제6장 기타 중요변경사항 ...39
    32. 제7장 참고문헌 ...40
    33. 제8장 첨부서류 ...41
  • 참고문헌

    1. 전체(0)
    2. 논문(0)
    3. 특허(0)
    4. 보고서(0)

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