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조직공학제품 및 생체재료의 미생물학적 안전성 평가법 확립(III)
A Study on Microbiological Evaluation of Human Cellular and Tissue-based Products

  • 사업명

    식품의약품안전성관리

  • 과제명

    조직공학제품 및 생체재료의 미생물학적 안전성 평가법 확립(III)

  • 주관연구기관

    충북대학교
    Chungbuk National University

  • 연구책임자

    송석길

  • 보고서유형

    최종보고서

  • 발행국가

    대한민국

  • 언어

    한국어

  • 발행년월

    2004-11

  • 과제시작년도

    2004

  • 주관부처

    식품의약품안전청

  • 사업 관리 기관

    식품의약품안전청
    Korea Food & Drug Administration

  • 등록번호

    TRKO201000016175

  • 과제고유번호

    1470000458

  • 키워드

    조직공학제품.항산성 세균.유전자 증폭법.Tissue-based product.Acid-fast bacteria.Gene amplification.

  • DB 구축일자

    2013-04-18

  • 초록 


    Human tissues are pivotal resources for medical treatments, such as burn treatment, joint or cartilage replacement, reconstructiv...

    Human tissues are pivotal resources for medical treatments, such as burn treatment, joint or cartilage replacement, reconstructive surgery, cancer care, and heart valve replacement. After ex vivo propagation, expansion, and selection, donor tissues can be transformed into many forms and then the cellular and tissue-based products can be transplanted to many people. Microbial diseases can be transmitted along with donor tissue or culture substrates. Because appropriate inspection and regulation must be applied to prevent this concern, it is necessary to develop detection method for presumed contamination of microorganisms. Lots of transmissible agents can be transmitted from a donor, thereby placing multiple recipients at risk. In this study, we have developed diagnostic PCR and RFLP methods that can detect and differentiate simultaneously the genetic materials of several mycobacteria species including M. tuberculosis, M. avium, M. bovis, M. gordonae, and M. kansasii. Mycobacterial species are the major infectious cause of human morbidity in the world and slow growing organisms, which makes diagnosis and handling laborous and time-consuming. Each primer pairs targeting a specific intervening region (ITS) between 16S and 23S rDNA or rpoB gene were used to detect five mycobacteria species and to increase specificity and sensitivity of amplification. The thermocycling parameters, primer sequences, and concentration of each reaction components were optimized systematically to achieve optimal sensitivity and specificity for each PCR reaction. The sensitivity of the detection method were enough to detect 100 copies of each genes from five mycobacteria. A RFLP typing method using Mspl or HaeIII leads to differentiate five similar species and a premixed reagent was used for all experimental steps to maintain reproducibility through whole experimental procedures. The results obtained provides an evidence that the assay system is a good tool for supporting the diagnosis of microbial contamination and can be used for screening donated tissue and its products, thereby being applicable as microbiological safety test for evaluating contamination of adventitious agents within cellular and tissue-based products.


    조직공학제품은 노화, 사고, 질병, 또는 유전성 요인에 의해 손상된 조직이나 장기를 대체하기 위한 것으로, 생체재료와 biochemical 및 합성물질 등을 이용하여 생산되기 때문에 다양한 미생물오염경로를 가진다. 생체재료와 조직공...

    조직공학제품은 노화, 사고, 질병, 또는 유전성 요인에 의해 손상된 조직이나 장기를 대체하기 위한 것으로, 생체재료와 biochemical 및 합성물질 등을 이용하여 생산되기 때문에 다양한 미생물오염경로를 가진다. 생체재료와 조직공학 제품은 수 많은 미생물의 오염이 가능하므로 안전성 시험법이 많은 오염원을 대상으로 효과적으로 이루어져야 할 필요가 있다. 인체에 질병을 유발하며 체외배양이 어려운 Mycobacteria 5종을 (M. tuberculosis, M. avium, M. bovis, M. gordonae, and M. kansasii)을 대상으로 유전자 증폭법에 근거한 미생물학적 안정성 시험법을 개발함으로서 직접배양법의 대체시험법을 확립할 필요가 있다. 최근에는 FISH(Fluorescent In Situ Hybridization), PNA(Peptide Nucleic Acid)-FISH, DNA 형광염색법 (Acridine Orange, 4,6-diamino-2-phenylindole, Propidium iodide 등), 산화 환원력시험법(5-cyano-2,3-ditoyl tetrazolium chloride) 등이 개발되어 왔으나, 많은 양의 세균수를 필요로 함은 물론 별도의 고가 장비(형광현미경, 흡광기)를 요구하므로 감도와 경제성 면에서 단점을 지닌다. 따라서 본 연구에서는 공정서 상의 무균시험법으로 검출이 용이하지 않은 난배양성 세균인 5종의 Mycobacteria 미생물을 효율적으로 검출할 수 있는 대체시험법을 개발하고자하였다. 먼저 한 개체의 미생물에 수백 copy가 존재하는 ribosomal RNA 유전자(rDNA)와 종 특이적 유전자인 rpoB를 대상으로 100 copy의 유전자 까지 검출 가능한 유전자 증폭기법을 확립하였다. 각각의 검출용 유전자 표준품을 확보하여 각 검출반응의 검증이 가능하도록 하였으며, HaeIII 및 Mspl을 이용한 RFLP법을 확립하여 오염균종의 확인이 가능하도록 하였다. 이때 검출감도, 특이성 및 재현성을 확보함으로서 검출법의 신뢰도를 높이도록 하였다. 따라서 본 연구에서 개발한 유전자 증폭법은 공정서에 수재된 직접배양법보다 시간과 감도면에서 효율적인 미생물 검출법으로 조직공학제품 및 재료의 미생물 부정시험으로 대체 가능하다고 판단된다.


  • 목차(Contents) 

    1. 연구결과보고서 ...1
    2. 제출문 ...2
    3. 요약문 ...3
    4. Project Summary ...4
    5. 목차 ...5
    6. 제1장 서론 ...6
    7. 1. 연구 목적 및 필요성 ...6
    8. 2. 연구내용 및 범위 ...12
    9. 제2장 국내.외 기술개발 현황 ...15<...
    1. 연구결과보고서 ...1
    2. 제출문 ...2
    3. 요약문 ...3
    4. Project Summary ...4
    5. 목차 ...5
    6. 제1장 서론 ...6
    7. 1. 연구 목적 및 필요성 ...6
    8. 2. 연구내용 및 범위 ...12
    9. 제2장 국내.외 기술개발 현황 ...15
    10. 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ...17
    11. 1. 연구내용 및 결과 ...17
    12. 2. 연구방법 ...31
    13. 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ...32
    14. 제5장 연구개발결과의 활용성과 및 계획 ...33
    15. 가. 계량적 성과 ...33
    16. 나. 성과내용기술 ...33
    17. 다. 활용계획 ...33
    18. 제6장 기타 중요변경사항 ...33
    19. 제7장 참고문헌 ...34
    20. 총괄 연구과제 요약 ...37
  • 참고문헌

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